細(xì)胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

細(xì)胞/組織活性高爾基體粗提分離試劑是一種旨在通過機(jī)械或化學(xué)處理，差速以及等密度離心方法，從動(dòng)物細(xì)胞或軟組織中分離出完整的活性高爾基體細(xì)胞器組分的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種動(dòng)物細(xì)胞或組織（人體、老鼠、兔子等）樣品中活性高爾基體的制備�？梢员挥糜谑荏w循環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗體釋放機(jī)制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。

 

技術(shù)背景

 

高爾基體（Golgi apparatus或Golgi body），又稱為高爾基復(fù)合體（Golgi complex），是大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞器組分，由40至100扁平片層或稱為小池（cisternae）堆疊成內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system），分成正側(cè)或內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)（cis-Golgi network）、近內(nèi)中間網(wǎng)絡(luò)（medial-Golgi）、內(nèi)腔網(wǎng)絡(luò)（endo-Golgi）、外側(cè)或反側(cè)網(wǎng)絡(luò)等（trans-Golgi）細(xì)胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其主要功能在于由內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)接受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡中的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子，處理（修飾、分類）和組裝后，由外側(cè)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)分泌到目標(biāo)位置。同時(shí)也是合成蛋白聚糖（proteoglycan）和碳水化合物的重要場(chǎng)所。高爾基體的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘?jiān)�碎屑和巨大�?xì)胞器；第三，可以通過等密度離心獲得高爾基體。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）   100毫升

裂解液（Reagent B）    30毫升

分離液A（Reagent C）    30毫升

分離液B（Reagent D）    30毫升

保存液（Reagent E）    70毫升

活性液（Reagent F）   200微升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

8毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

4℃超速離心機(jī)：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

平式搖蕩儀：用于混勻

3號(hào)針筒和18號(hào)針頭：用于收集樣品

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 細(xì)胞樣品

 

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的3毫升裂解液（Reagent B）
• 加入20微升活性液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為3000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取3毫升的分離液A（Reagent C）到8毫升超速離心管 
• 小心加入3毫升的分離液B（Reagent D）在分離液A（Reagent C）的上面，避免震動(dòng)
• 輕輕加入2毫升上述高爾基體混勻液在分離液B（Reagent D）的上面，避免震動(dòng)
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心4小時(shí)，速度為100000g
• 小心取出超速離心管：可見樣品和分離液B（Reagent D）交界處棕色或乳黃色樣品帶
• 小心收集高爾基體樣品帶到8毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）
• 加入6毫升保存液（Reagent E）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液（注意：為白色或絮狀沉淀，較為松散）
• 加入500微升保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

• 組織樣品

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，避免或去除脂肪組織，秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的3毫升裂解液（Reagent B）
• 加入20微升活性液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為3000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取3毫升的分離液A（Reagent C）到8毫升超速離心管 
• 小心加入3毫升的分離液B（Reagent D）在分離液A（Reagent C）的上面，避免震動(dòng)
• 輕輕加入2毫升上述高爾基體混勻液在分離液B（Reagent D）的上面，避免震動(dòng)
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心4小時(shí)，速度為100000g
• 小心取出超速離心管：可見樣品和分離液B（Reagent D）交界處棕色或乳黃色樣品帶
• 小心收集高爾基體樣品帶到8毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）
• 加入6毫升保存液（Reagent E）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液（注意：為白色或絮狀沉淀，較為松散）
• 加入500微升保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次（1克動(dòng)物組織或5 X 10⁷細(xì)胞）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、分離液A/B（Reagent C/D）和保存液（Reagent E）
• 樣品處理避免使用EDTA，否則影響分離效果
• 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整分離液A/B（Reagent C/D）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 通常5 X 10⁷細(xì)胞或1克動(dòng)物組織的高爾基體含量為15微克蛋白

11． 本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度和產(chǎn)量最為理想

12． 高爾基體的標(biāo)志蛋白是UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glactosyl transferase）；建議使用純化高爾基體UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glactosyl transferase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒－50414.3

• 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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