銅離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能（P型ATP酶）綠色熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

 

主要用途

 

銅離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能（P型ATP酶）綠色熒光檢測(cè)試劑是一種旨在使用銅離子熒光探針，自由進(jìn)入囊泡內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)，一旦銅離子進(jìn)入產(chǎn)生熒光淬滅，來分析和觀察銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)一步評(píng)價(jià)P型ATP酶中的銅ATP酶功能的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物、人體、真菌/酵母、植物細(xì)胞或細(xì)胞器（高爾基體、線粒體、溶酶體、囊泡、胞漿等）銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，即P型ATP酶的銅ATP酶功能的檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

細(xì)胞膜上的膜整合蛋白（integral membrane protein）參與細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)傳輸、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，構(gòu)成離子或代謝分子的通道，常見的包括氫離子、鈉離子、鉀離子、重金屬離子等，在能量依賴型或非依賴型的條件下，完成生理代謝的物質(zhì)交換。膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能檢測(cè)（transport或uptake assay）用于分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（transport protein）和底物（substrate）的功能、篩選通道抑制劑、進(jìn)而發(fā)現(xiàn)藥物以及抗藥性機(jī)制。建立分子構(gòu)建的載體或宿主模型、分離膜性囊泡（membrane vesicle）包括正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）或內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡（In-side out；IOV），通過標(biāo)記底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，來定量測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)活性。銅離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能，即銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶（copper transporting P-type ATPase）或重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶（heavy metal transporting P-type ATPase），分成兩種：ATP7A（Menkes病蛋白；Menkes disease protein）和ATP7B（Wilson病蛋白；Wilson disease protein），前者異常導(dǎo)致系統(tǒng)性銅缺陷，而出現(xiàn)神經(jīng)退行性病變；后者異常導(dǎo)致導(dǎo)致肝臟和腦組織銅堆積，而產(chǎn)生肝硬化和腦變性病變。銅離子作為機(jī)體第三大瞬時(shí)性必需微量金屬（transition metal）和多種酶（細(xì)胞色素C氧化酶和過氧化物歧化酶等）的輔因子，通過銅ATP酶，控制銅離子的吸收、聚集、運(yùn)送、去毒等作用，維持微環(huán)境銅離子平衡（濃度為10^-18至-13摩爾），實(shí)現(xiàn)銅離子的生理功能，包括線粒體電子傳導(dǎo)、病原菌防御、植物細(xì)胞壁木質(zhì)化（lignification）、維生素C代謝、固氮、碳水化合物代謝、脂肪酸羥基化和去飽和化等。通過使用銅離子熒光探針Phen Green，一種金屬結(jié)合性菲咯啉（phenanthroline）二價(jià)連接在熒光素上的熒光化合物，自由性進(jìn)入各種細(xì)胞或囊泡（vesicle）內(nèi)，在ATP的存在下，銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過質(zhì)膜，與熒光探針結(jié)合，使綠色熒光淬滅（激發(fā)波長(zhǎng)506nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm），以分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P型ATP酶中銅ATP酶的功能，以及其抑制劑的篩選。  

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  80毫升

標(biāo)記液（Reagent B）   1毫升

離子液（Reagent C）   1毫升

補(bǔ)充液（Reagent D）   1毫升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保證6月

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

1毫升比色皿：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀：用于熒光定量分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 確定測(cè)定對(duì)象：動(dòng)物/人體、真菌/酵母或植物
• 分離膜性囊泡（注意：建議使用系列分離試劑盒產(chǎn)品）：

 

膜性囊泡選擇	檢測(cè)目的
RSOV（正常外向膜性囊泡（Right-side out）	銅離子流入檢測(cè)（influx或uptake）
IOV（內(nèi)側(cè)外翻膜性囊泡（In-side out）	銅離子外流檢測(cè)（efflux）

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)的分離樣品，置于冰槽里備用

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 開啟并設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm，間隔15秒測(cè)讀1次，持續(xù)5分鐘，并置零
• 實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置于室溫下凍融預(yù)熱，避免光照。然后進(jìn)行下列操作

 

• 熒光測(cè)定

 

• 準(zhǔn)備2個(gè)1.5毫升離心管，并標(biāo)記為對(duì)照樣品管、抑制劑樣品管
• 分別加入800微升緩沖液（Reagent A） 
• 加入50微升補(bǔ)充液（Reagent D）到對(duì)照樣品管
• 加入50微升用戶自備的抑制劑（注意：使用各種濃度梯度）到抑制劑樣品管（注意：如果檢測(cè)樣品銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)，可以省略這一操作）
• 分別加入100微升待測(cè)樣品（500微克蛋白或5 X 10⁴細(xì)胞）
• 分別加入50微升標(biāo)記液（Reagent B）
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育10分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 分別小心抽去上清液，避免液體殘留
• 分別加入1毫升緩沖液（Reagent A），混勻顆粒群
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 分別小心抽去上清液，避免液體殘留
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11至13一次
• 分別加入1毫升緩沖液（Reagent A），混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)移到比色皿或酶標(biāo)板
• 分別加入20微升離子液（Reagent C）
• 小心槍頭混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀（激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm）：獲得0分鐘和設(shè)定系列時(shí)間至5分鐘的相對(duì)熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）――

RFU降低，表明銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能活性增強(qiáng)

• 構(gòu)建轉(zhuǎn)運(yùn)曲線：縱座標(biāo)（Y）為相對(duì)熒光單位（RFU），橫座標(biāo)（X）為時(shí)間（秒或分鐘）
• 構(gòu)建抑制曲線（設(shè)定終點(diǎn)5分鐘）：縱座標(biāo)（Y）為相對(duì)熒光單位（RFU），橫座標(biāo)（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
• 構(gòu)建百分率抑制曲線（設(shè)定5分鐘）：縱座標(biāo)（Y）為抑制百分率（％），橫座標(biāo)（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
• 根據(jù)上述曲線，計(jì)算IC50（50％抑制率所需的抑制劑濃度）

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議用戶使用本公司的膜性囊泡（RSOV）制備試劑盒準(zhǔn)備樣品
• 孵育時(shí)，避免光照
• 建議加入離子液（Reagent C）后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 用戶根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，可以調(diào)整終點(diǎn)時(shí)間：2分鐘、3分鐘、5分鐘
• 用戶可以在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，加入抑制劑，觀察轉(zhuǎn)運(yùn)走勢(shì)變化
• 銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)單位可以使用ΔRFU/分鐘/毫克蛋白等
• 可以使用銅螯合劑三乙烯四胺二鹽酸鹽（triethylenetetramine dihydrochloride；20微摩爾）作為抑制劑對(duì)照
• 本公司提供系列離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能（transport/uptake）分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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