雙參數(shù)細胞周期S期流式細胞分析試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

雙參數(shù)細胞周期S期流式細胞分析試劑是一種旨在使用溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）和DNA含量雙重參數(shù)在細胞流式儀下，分析和區(qū)分細胞周期S期的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細胞（動物、人體、植物等）的細胞周期S期分析。廣泛用于細胞繁殖，包括細胞衰老、細胞凋亡的研究。產品嚴格無菌，即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術背景

 

細胞周期是評價細胞代謝、生理和病理狀況的重要指標。通過DNA結合染料這一單一參數(shù)（univariate parameter），借助細胞流式儀，測定出DNA含量，根據(jù)DNA含量隨著細胞周期的不同而發(fā)生變化，來確定和區(qū)別細胞周期的不同階段，形成三種不同的細胞群，包括G0/G1、S、G2/M。而使用雙參數(shù)（bivariate parameter），即特異性細胞周期表達蛋白和DNA含量，則可以區(qū)分G0和G1，G2和M。其中細胞周期素（cyclins）是細胞周期進程機制的關鍵元素和標志（landmark）。溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine；BrdU）是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入DNA合成期（S期）細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，來分析細胞周期S期分布情況。流式細胞術（FLOW CYTOMETRY）是七十年代發(fā)展起來的集計算機、激光、流體力學、細胞化學、細胞免疫學為一體的高科學技術。

 

產品內容

 

標記液（Reagent A）         300微升

清理液（Reagent B）    100毫升

固著液（Reagent C）     50毫升

修復液（Reagent D）     10毫升

變性液（Reagent E）     10毫升

中和液（Reagent F）     10毫升

抗體液（Reagent G）    700微升

封阻液（Reagent H）     40毫升

熒光液（Reagent I）    600微升

復染液（Reagent J） 5毫升

產品說明書 1份

 

保存方式

 

保存標記液（Reagent A）、固著液（Reagent C）、修復液（Reagent D）、抗體液（Reagent G）、封阻液（Reagent H）、熒光液（Reagent I）和復染液（Reagent J）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗體液（Reagent G）和熒光液（Reagent I）嚴禁反復凍融；標記液（Reagent A）、熒光液（Reagent I）和復染液（Reagent J），避免光照；有效保證6月

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于細胞收集的操作

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

臺式離心機：用于細胞收集的操作

微型臺式離心機：用于細胞收集的操作

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作：

• 準備1個6孔細胞培養(yǎng)板的細胞（1 X 10⁶細胞/3毫升培養(yǎng)液/孔）
• 加入30微升標記液（Reagent A），避免光照
• 輕輕搖動培養(yǎng)板，混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱孵育1小時，避免光照
• 小心抽去含有標記液（Reagent A）細胞培養(yǎng)液
• 加入2毫升清理液（Reagent B），鋪滿培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液（Reagent B）
• 重復實驗步驟6至7一次
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱孵育1分鐘
• 加入3毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
• 移取細胞混勻液到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升清理液（Reagent B），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入200微升清理液（Reagent B），混勻細胞顆粒群
• （選擇步驟）細胞計數(shù)
• 同時準備1個－20℃預冷的新的15毫升錐形離心管
• 加入5毫升－20℃預冷的固著液（Reagent C）
• 用200微升槍頭一滴一滴加入細胞懸液到含有預冷的固著液（Reagent C）里，保持輕度渦旋震蕩
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升修復液（Reagent D），上下抽吸混勻
• 轉移到1.5毫升離心管
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入1毫升變性液（Reagent E）
• 渦旋震蕩3秒
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入1毫升中和液（Reagent F）
• 渦旋震蕩3秒
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入70微升抗體液（Reagent G），充分混勻
• 室溫下孵育30分鐘
• 加入1毫升封阻液（Reagent H），混勻
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入60微升熒光液（Reagent I），充分混勻
• 室溫下孵育45分鐘，避免光照
• 加入1毫升封阻液（Reagent H），混勻
• 渦旋震蕩3秒
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟51至54二次
•  加入500微升復染液（Reagent J），用槍頭充分混勻
• 移入到細胞流式儀專用測試管（可放進4℃冰箱里待測），避免光照
• 即刻進行細胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光器，觀察50000個細胞以上
• 建立地形圖或散點圖以及直方圖分析

 

	熒光液（Reagent I）	復染液（Reagent J）
熒光染料	異硫氰酸熒光素（FITC）	碘化丙啶（Propidium iodide；PI）
熒光顏色	綠色	紅色
散發(fā)波長	530	575（使用phycoerythrin的信號檢測）
流式儀通道	FL1	FL2
作用	BrdU的整合	DNA含量

 

• 根據(jù)地形圖或散點圖，縱坐標Y軸為FL1（BrdU綠色熒光），橫坐標X軸為FL2（PI紅色熒光），分析如下：

• 根據(jù)橫坐標X軸的DNA指數(shù)（DNA Index；DI）進行區(qū)域窗口劃分（見參考圖）
• 確定S期區(qū)域窗口或直接確定總細胞數(shù)
• 計算（S期區(qū)域窗口的）BrdU陽性細胞數(shù)：S期細胞數(shù)
• 獲得S期在細胞周期中的百分比
• 獲得單個區(qū)域窗口的Y軸的BrdU平均熒光讀數(shù)
• 根據(jù)BrdU平均熒光讀數(shù)，構建S細胞周期動態(tài)變化曲線――縱坐標為BrdU，橫坐標為時間或藥物濃度等
• 參考圖如下：

 

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作量
• 在整個操作過程中須戴手套，以防污染
• 孵育時，必須避免光照
• 建議不用抗體液（Reagent G），作為陰性對照
• 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞流式儀分析。如果放進4℃冰箱里待測，不要超過3天
• 細胞流式儀分析前，須混勻內容物
• 細胞檢測量不得少于10000個
• 檢測時，須彌補電子補償，以去除雙重參數(shù)的光譜重疊
• 告知流式儀技術員有關細胞類型
• 本公司提供系列細胞周期檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定標記清晰

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