HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE細(xì)胞膜變檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

 

主要用途

 

HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE細(xì)胞膜變檢測試劑是一種旨在通過熒光染料的細(xì)胞膜差異通透性（differential permeability）呈現(xiàn)的DNA結(jié)合性熒光，來分析細(xì)胞膜損傷與否，進(jìn)而定性或定量區(qū)別活細(xì)胞、死細(xì)胞（壞死細(xì)胞）和凋亡細(xì)胞狀況的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞類型（動物、人體、植物、昆蟲等）的觀察。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，熒光清晰，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

赫斯特染料（Hoechst 33342）為特異性 DNA 活性染料，與 A-T 鍵結(jié)合，其激發(fā)波長是350nm，散發(fā)波長是460nm，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；而碘化丙啶（Propidium iodide；PI）為DNA堿基嵌入劑，沒有堿基結(jié)合優(yōu)先性，其激發(fā)波長是488nm，散發(fā)波長是630nm，呈現(xiàn)紅色熒光。根據(jù)熒光染料的膜通透性特征：第一，定性確定細(xì)胞膜的損傷狀況；第二，定性或定量區(qū)別正�；罴�(xì)胞、死細(xì)胞（壞死細(xì)胞）、凋亡細(xì)胞等。正�；罴�(xì)胞，其胞膜完整，拒絕兩種染料進(jìn)入胞內(nèi)；死細(xì)胞，其胞膜完全破損，可以呈現(xiàn)兩種熒光；凋亡細(xì)胞，選擇性拒絕碘化丙啶進(jìn)入，允許赫斯特染料進(jìn)入，且熒光強(qiáng)度高于正�；罴�(xì)胞。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A） 150毫升

YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）  35毫升

YIJI染色液A（Reagent C） 200微升

YIJI染色液B（Reagent D） 200微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI染色液A（Reagent C）和YIJI染色液B（Reagent D）在－20℃冰箱里，用鋁箔封裹，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞收集的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作

熒光顯微鏡：用于觀察細(xì)胞熒光染色

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，從－20℃冰箱里取出YIJI染色液A（Reagent C）和YIJI染色液B（Reagent D），置入冰槽里融化，避免光照。移出350微升YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）和4微升YIJI染色液A（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，混勻后標(biāo)記為YIJI染色工作液A。再次移出350微升YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）和4微升YIJI染色液B（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，混勻后標(biāo)記為YIJI染色工作液B。然后進(jìn)行下列操作：

 

• 直接法

 

• 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)12孔板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約30萬細(xì)胞數(shù)）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去1毫升 YIJI清理液（Reagent A）
• 小心加入354微升含有YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）和YIJI染色液A（Reagent C）的YIJI染色工作液A， 覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 即刻置于冰槽里
• 小心加入354微升含有YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）和YIJI染色液B（Reagent D）的YIJI染色工作液B， 覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 在冰槽里孵育10分鐘
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去1毫升 YIJI清理液（Reagent A）
• 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：同一視野，先使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞位置，然后使用紫外熒光觀察藍(lán)色細(xì)胞，最后使用紅色熒光，觀察紅色細(xì)胞。按照下表進(jìn)行分析：

 

	YIJI染色液A（Reagent C）	YIJI染色液B（Reagent D）
熒光染料	HOECHST 33342	PROPIDIUM IODIDE
熒光參數(shù)	激發(fā)：350nm；散發(fā)：460nm	激發(fā)：488nm；散發(fā)：630nm
熒光顏色	藍(lán)色	紅色
正�；罴�(xì)胞	無熒光或低藍(lán)色熒光	無熒光
死亡（壞死）細(xì)胞	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	強(qiáng)烈紅色熒光
凋亡細(xì)胞	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	無熒光
膜完整	無熒光	無熒光
輕度膜損傷變化	藍(lán)色熒光	無熒光
中度膜損傷變化	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	紅色熒光
重度膜損傷變化	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	強(qiáng)烈紅色熒光

 

• 間接法

 

• 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)12孔板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約30萬細(xì)胞數(shù)）
• 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細(xì)胞）
• 加入1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心移出1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管（收集洗脫細(xì)胞）
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落
• 加入1毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI清理液（Reagent A）
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入354微升含有YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）和YIJI染色液A（Reagent C）的YIJI染色工作液A，混勻
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入354微升含有YIJI補(bǔ)充液（Reagent B）和YIJI染色液B（Reagent D）的YIJI染色工作液B，混勻
• 在冰槽里孵育10分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
• 即刻移取50微升在載玻片上壓片
• 在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：同一視野，先使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞位置，然后使用紫外熒光觀察藍(lán)色細(xì)胞，最后使用紅色熒光，觀察紅色細(xì)胞。按照下表進(jìn)行分析：

 

	YIJI染色液A（Reagent C）	YIJI染色液B（Reagent D）
熒光染料	HOECHST 33342	PROPIDIUM IODIDE
熒光參數(shù)	激發(fā)：350nm；散發(fā)：460nm	激發(fā)：488nm；散發(fā)：630nm
熒光顏色	藍(lán)色	紅色
正�；罴�(xì)胞	無熒光或低藍(lán)色熒光	無熒光
死亡（壞死）細(xì)胞	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	強(qiáng)烈紅色熒光
凋亡細(xì)胞	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	無熒光
膜完整	無熒光	無熒光
輕度膜損傷變化	藍(lán)色熒光	無熒光
中度膜損傷變化	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	紅色熒光
重度膜損傷變化	強(qiáng)烈藍(lán)色熒光	強(qiáng)烈紅色熒光

 

• 或轉(zhuǎn)入到細(xì)胞流式儀專用測試管，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：觀察50000個細(xì)胞以上
• 建立地形圖或散點(diǎn)圖以及直方圖分析

 

	YIJI染色液A（Reagent C）	YIJI染色液B（Reagent D）
熒光染料	HOECHST 33342	PROPIDIUM IODIDE
熒光顏色	藍(lán)色	紅色
激發(fā)波長	350	488（使用phycoerythrin的信號檢測）
流式儀通道	FL1	FL2
正�；罴�(xì)胞	低熒光；左下象限	低熒光；左下象限
死亡（壞死）細(xì)胞	高熒光；右上象限（也可左上象限）	高熒光；右上象限（也可左上象限）
凋亡細(xì)胞	高熒光；右下象限	低熒光；右下象限

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為50次（8個12孔細(xì)胞培養(yǎng)板）操作
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，須收集所有懸浮和貼壁細(xì)胞；同時要確保足夠的細(xì)胞數(shù)
• 可用35mm培養(yǎng)皿、6孔培養(yǎng)板或25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶操作，相應(yīng)增加染色液的用量。但12孔培養(yǎng)板為理想選擇
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，須避免光照
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行分析
• 細(xì)胞流式儀分析前，須混勻內(nèi)容物
• 細(xì)胞流式儀分析，細(xì)胞檢測量不得少于10000個
• 細(xì)胞類型不同，對于染色的反應(yīng)會不同
• 告知流式儀技術(shù)員有關(guān)細(xì)胞類型
• 本公司提供系列細(xì)胞凋亡試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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