細(xì)胞分泌型堿性磷酸酶活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞分泌型堿性磷酸酶活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過底物熒光素二磷酸受到分泌型堿性磷酸酶的水解，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，在熒光分光光度儀下，呈現(xiàn)熒光值的變化，即采用熒光法定量測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。常用于分子生物學(xué)報(bào)告基因系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。其適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及動(dòng)物血清中分泌型堿性磷酸酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

堿性磷酸酶（Alkaline Phophatase；ALP或ALKP；EC3.1.3.1），是一種在堿性環(huán)境下，水解并移去各種類型分子中的磷酸基團(tuán)的酶蛋白。存在于所有人體組織以及其它生物體。動(dòng)物堿性磷酸酶有四種不同的分別來自于小腸/胎盤/骨組織、肝組織和腎組織的同功酶。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常使用蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase；SAP）、牛小腸堿性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase；CIP）、胎盤堿性磷酸酶（placental alkaline phosphatase；PALP）和分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase；SEAP）。其中分泌型堿性磷酸酶是截?cái)嘈停╰rancated），且膜結(jié)合性胎盤堿性磷酸酶，常用于報(bào)告基因（reported gene），檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的真核細(xì)胞或組織啟動(dòng)子的活性以及基因表達(dá)水平�；�于在鎂離子的促進(jìn)作用下，分泌型堿性磷酸酶催化水解底物熒光素二磷酸（3,6-Fluorescein diphosphate；FDP），釋放出熒光素（Fluorescein）和磷酸（phosphate），通過熒光分光光度儀檢測(cè)熒光素（激發(fā)波長(zhǎng)485nm；散發(fā)波長(zhǎng)528nm），來定量測(cè)定分泌型堿性磷酸酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

  SEAP

3,6-Fluorescein diphosphate  +  H2O    →   Fluorescein  +  inorganic phosphate

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI緩沖液（Reagent A）   5毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent B） 400微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；YIJI反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證3月；一旦打開使用，有效保證1至2月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或黑色96孔板：用于熒光測(cè)定的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

選擇一：細(xì)胞培養(yǎng)基樣品

• 移取1毫升待測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)65℃恒溫水槽孵育15分鐘（注意：去除內(nèi)源性堿性磷酸酶干擾）
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

選擇二：血清樣品

• 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的抗凝管里
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 放進(jìn)65℃恒溫水槽孵育15分鐘（注意：去除內(nèi)源性堿性磷酸酶干擾）
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)讀準(zhǔn)備

 

• 開啟熒光分光光度儀預(yù)熱
• 設(shè)定好熒光分光光度儀：溫度37℃，激發(fā)波長(zhǎng)485nm；散發(fā)波長(zhǎng)528nm，間隔60秒，測(cè)讀6次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

三、背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取190微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B） 
• 即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（5秒鐘內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)，獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）：此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

四、樣品測(cè)定

 

• 移取170微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升待測(cè)樣品（注意：或總量20微克總蛋白）
• 加入10微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B） 
• 即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（5秒鐘內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)，獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）：此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 計(jì)算樣品活性

 

1．計(jì)算公式

RFU_{樣品讀數(shù)}－RFU_{背景讀數(shù)} 

 

2．繪制RFU讀數(shù)（Y軸）和時(shí)間（X軸）關(guān)系曲線

 

• 熒光酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取170微升YIJI緩沖液（Reagent A）到96孔板中
• 分別加入20微升YIJI緩沖液（Reagent A）或待測(cè)樣品（或10微克總蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算

 

1）計(jì)算公式

RFU_{樣品讀數(shù)}－RFU_{背景讀數(shù)} 

 

2）繪制RFU讀數(shù)（Y軸）和時(shí)間（X軸）關(guān)系曲線

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 本產(chǎn)品檢測(cè)敏感度可達(dá)0.1納克或1微單位活性
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品避免使用磷酸鹽緩沖溶液等處理
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 加入YIJI反應(yīng)液（Reagent B）后5秒內(nèi)進(jìn)行熒光測(cè)定
• 熒光測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定相對(duì)熒光讀數(shù)升高表明具有酶活性
• 樣品測(cè)定可以持續(xù)5分鐘；如果酶活較低，可以持續(xù)檢測(cè)30分鐘，甚至16小時(shí)
• 用戶可以使用純化的堿性磷酸酶作為陽性對(duì)照或構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線
• 建議待測(cè)樣本總蛋白濃度為10至20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 膽紅素（Bilirubin）、脂類（lipid）、葡萄糖（glucose）、抗壞血酸（ascorbic acid）和EDTA將干擾測(cè)定
• 本公司提供系列磷酸化酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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