海洋動物蝦貝類組織線粒體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI海洋動物蝦貝類組織線粒體粗提分離試劑是一種旨在從海洋動物蝦貝類軟體組織中分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種海洋動物軟體組織的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、能量代謝、蛋白組學(xué)和病理生理學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品最佳。

 

技術(shù)背景

 

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。線粒體的核酸遺傳物質(zhì)，具有進(jìn)化速度快、非重組變異和母系遺傳等特點，已成為最廣泛使用的分子系統(tǒng)學(xué)標(biāo)記之一， 已廣泛應(yīng)用于海洋動物學(xué)，尤其是蝦貝類的分類學(xué)、群體遺傳學(xué)和近緣種間系統(tǒng)發(fā)育研究。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A）   100毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI凈化液（Reagent C）    30毫升

YIJI酶解液（Reagent D）    50毫升

YIJI保存液（Reagent E）    35毫升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI酶解液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月 

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于組織收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺式離心機(jī)：用于沉淀組織細(xì)胞

4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

 

 

實驗步驟

 

• 軟體組織線粒體分離

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 取出待測動物組織，并秤重1克組織重量  
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）小心抽去清洗液
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入5毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入YIJI線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

 

二、軟體肌肉組織線粒體分離

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的YIJI凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 取出待測動物組織，并秤重1克組織重量  
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）小心抽去清洗液
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI酶解液（Reagent D），充分混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育3分鐘
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心2分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的3毫升YIJI清理液（Reagent A）和2毫升 YIJI凈化液（Reagent C），充分混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心2分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （注意：如果進(jìn)行線粒體DNA萃取，直接進(jìn)入YIJI線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次（1克動物組織）操作
• 所有操作均須嚴(yán)格在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為80下達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常1克動物組織的線粒體含量為50微克線粒體蛋白；但海洋動物的線粒體含量較低，平均每個細(xì)胞含有2000個線粒體不等

9． 如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

10． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量最為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應(yīng)減少

11． 如果需要獲得99％以上純度的線粒體，使用YIJI海洋動物（蝦貝類）高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒－GMS10063.3 

• 線粒體正�；钚詼y定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供用戶完全解決方案服務(wù)
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

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