動物血小板線粒體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI動物血小板線粒體粗提分離試劑是一種旨在通過低速差速離心和化學(xué)滲壓休克處理純化血小板、以及物理或化學(xué)破膜和高速差速離心的方法，直接從動物血細(xì)胞中分離出完整而純化的血小板線粒體細(xì)胞器的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于人體和各種動物全血（鼠、豬、羊等）中血小板線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、信號傳遞、能量代謝、蛋白組學(xué)和古生物學(xué)、病理生理學(xué)（神經(jīng)病變或腫瘤）等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度保證。

 

技術(shù)背景

 

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A）   250毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI凈化液（Reagent C）    10毫升

YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）     5毫升

YIJI保存液（Reagent E）   100毫升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存YIJI凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃臺式離心機(jī)：用于樣品操作

4℃超速離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

超聲儀：用于裂解細(xì)胞

 

 

 

實驗步驟

 

• 物理處理法

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升YIJI凈化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細(xì)胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細(xì)胞顆粒群松動
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放入臺式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進(jìn)－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 加入5毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約10下）（注意：參見注意事項11）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）置于超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• （選擇步驟）超聲功率為60％（或150赫茲）猝擊10秒，間隙30秒，10個循環(huán)
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

 

 

• 化學(xué)處理法

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升YIJI凈化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內(nèi)抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細(xì)胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細(xì)胞顆粒群松動
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）
• （選擇步驟）放入含有上清液的離心管到臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為200g
• （選擇步驟）小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細(xì)胞顆粒群（扔掉含有細(xì)胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 可見白色沉淀顆粒群，小心抽掉上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液(Reagent A)，混勻細(xì)胞顆粒群
• 放入臺式離心機(jī)離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進(jìn)－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 入5毫升預(yù)冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項12）
• 加入5毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的YIJI保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

 

 

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次（10至20毫升全血/次）操作
• 其它實際操作的全血容量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如40毫升全血，試劑用量加倍
• 操作時，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 操作時，須戴手套
• 建議使用新鮮全血：2小時內(nèi)的全血為理想狀態(tài)，不要超過24小時
• 全血樣品采集須使用全血樣品采集須使用EDTA二鉀血液抗凝液（GMS12059.1）、ACD血液抗凝液（GMS12059.4），或肝素鈉血液抗凝液（GMS12059.5）
• 建議使用足夠的樣品量
• 血小板提取量因人而異；如果不足，建議增加全血量
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為10下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 物理處理法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常每毫升全血平均可獲得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板線粒體含量為10至25微克線粒體蛋白

16． 如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

17． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量最為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應(yīng)減少

18． 如果需要獲得95％以上純度的線粒體，使用YIJI動物血小板高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒－GMS10062.3 

• 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

上海一基實業(yè)有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對照品、抗體|抗原、生物試劑、動物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說明等物理性質(zhì)信息請聯(lián)系客服為您查詢！質(zhì)量保證，價格優(yōu)惠，是國內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專業(yè)經(jīng)銷生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測設(shè)備，實施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來電咨詢!