高度適用于表觀遺傳學(xué)研究的檢測(cè)工具

焦磷酸測(cè)序技術(shù)配合QIAGEN表觀遺傳學(xué)產(chǎn)品線，提供高度可靠的序列數(shù)據(jù)，能夠準(zhǔn)確、靈敏的定量分析甲基化水平。甚至能夠檢測(cè)新的突變，以及低水平的DNA異常甲基化。PyroMark Q24包括了一個(gè)完整軟件包，用于分析CpG位點(diǎn)甲基化，以及用于確認(rèn)亞硫酸氫鹽處理徹底與否的內(nèi)置的對(duì)照。

定量分析單個(gè)CpG位點(diǎn)

分析單個(gè)CpG位點(diǎn)對(duì)于研究各種腫瘤基因的異常表達(dá)是非常重要的。由于傳統(tǒng)方法獲得的數(shù)據(jù)分辨率低，通常靈敏度不高。焦磷酸測(cè)序技術(shù)克服了這一局限，可高度精確地分析有一個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化序列單個(gè)位點(diǎn)的變化。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)基于測(cè)序原理，數(shù)分鐘內(nèi)可獲得定量數(shù)據(jù)。PyroMark Q24是提供實(shí)時(shí)測(cè)序信息的完整體系，高度適用于表觀遺傳學(xué)研究和遺傳分析。該系統(tǒng)包括PyroMark Q24、PyroMark Q24 Vacuum Workstation、PyroMark Q24 Software、PyroMark Gold Q24 Reagents、PyroMark Control Oligo和PyroMark Q24 Validation Oligo（見表）。同時(shí)提供樣本制備方案，可使用PyroMark 24 Vacuum Workstation制備單鏈DNA。

高度適用于遺傳分析的平臺(tái)

遺傳分析涵蓋多種分析基因組DNA差異的應(yīng)用，包括突變檢測(cè)和SNP分型。PyroMark Q24可精確、高度靈敏地分析靶基因突變和定量分析混合細(xì)胞群體的等位基因頻率。QIAGEN采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)為基因突變分析提供經(jīng)優(yōu)化和驗(yàn)證的RUO檢測(cè)。

焦磷酸測(cè)序反應(yīng)步驟：

步驟1：擴(kuò)增DNA片段，作為焦磷酸測(cè)序模板的單鏈?zhǔn)巧�物素�?biāo)記的。變性后，分離生物素標(biāo)記的單鏈PCR擴(kuò)增子，與測(cè)序引物雜交。雜交的引物和單鏈模板同各種酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和熒光素一起孵育。

步驟2：第一個(gè)脫氧核苷三磷酸（dNTP）加入反應(yīng)中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP結(jié)合到DNA鏈上與其互補(bǔ)的堿基位。每次結(jié)合都會(huì)釋放與核苷酸相等摩爾量的焦磷酸（PPi）。

步驟3：在有APS的條件下，ATP硫酸化酶將PPi轉(zhuǎn)化為ATP。在這個(gè)ATP的驅(qū)動(dòng)下，熒光素酶將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，并產(chǎn)生可見光，可見光的量與ATP的量成正比。通過電荷耦合（CCD）相機(jī)即可檢測(cè)到熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的可見光，并在原始數(shù)據(jù)輸出（Pyrogram）中顯示為一個(gè)峰，每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與結(jié)合的核苷酸數(shù)量成正比。

步驟4：三磷酸腺苷雙磷酸酶，是一種核苷酸降解酶，會(huì)降解未結(jié)合的核苷酸與ATP。完全降解后，加入另一個(gè)核苷酸。

步驟5：持續(xù)添加dNTP。α-硫代脫氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反應(yīng)中用于替代天然脫氧腺苷三磷酸（dATP），這是因?yàn)镈NA聚合酶可高效的應(yīng)用前者，而不被熒光素酶識(shí)別。當(dāng)該過程連續(xù)進(jìn)行時(shí)，就會(huì)形成互補(bǔ)的DNA鏈，可根據(jù)Pyrogram追蹤的信號(hào)峰確定核苷酸序列。

簡(jiǎn)化的工作流程—從樣本到結(jié)果

多功能PyroMark Q24與表觀遺傳學(xué)和遺傳學(xué)分析流程無縫接合，且與QIAGEN先進(jìn)的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增技術(shù)兼容。借助于高度可靠的儀器可在測(cè)序水平上對(duì)CpG位點(diǎn)和突變進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。簡(jiǎn)化的工作流程可更快速地獲得結(jié)果。

快速方便的樣本制備

從PCR產(chǎn)物到直接用于測(cè)序的單鏈模板，應(yīng)用PyroMark Q24 Vacuum Workstation可在15分鐘內(nèi)同時(shí)制備24個(gè)樣本。該工作站操作簡(jiǎn)單，且手動(dòng)時(shí)間少于5分鐘。

在焦磷酸測(cè)序之前，形成了一個(gè)生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物結(jié)合到覆蓋鏈酶親和素的瓊脂糖凝膠珠上。這些膠珠會(huì)被真空儀器捕捉并徹底清洗，隨后變性，得到適合于焦磷酸測(cè)序的單鏈DNA。該模板DNA放入含測(cè)序引物的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)板中，隨后引物退火，再將該板放入PyroMark儀器中即可。PyroMark Gold試劑包含用于焦磷酸測(cè)序反應(yīng)的酶、核苷酸和底物，將這些試劑加入分配吸頭或卡夾（取決于儀器），按照軟件中提供的體積，試劑被加入到儀器中，用于焦磷酸測(cè)序。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)各個(gè)領(lǐng)域的研究應(yīng)用至關(guān)重要。焦磷酸測(cè)序技術(shù)能夠靈敏的分析遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的變化，如檢測(cè)病原體中藥物抗性的發(fā)展，基因表達(dá)分析中表觀遺傳學(xué)DNA甲基化的作用、牲畜特異性表現(xiàn)型的遺傳標(biāo)記，以及法醫(yī)檢材樣本中線粒體DNA的多態(tài)性。此外，由于焦磷酸測(cè)序技術(shù)整合了序列檢測(cè)和定量，提高了分析靈敏度，助于發(fā)現(xiàn)新的信息。

 易于使用的PyroMark Q24軟件 

安裝在電腦上的PyroMark Q24軟件能夠全面分析您的結(jié)果。該軟件包含兩個(gè)分析程序：CpG和AQ（等位基因定量）。兩個(gè)程序可在同一塊板上分析樣本，并且能夠同時(shí)檢測(cè)不同類型的樣本。AQ程序用于分析單個(gè)和多個(gè)位點(diǎn)，以及雙、三和四等位突變。CpG程序能夠分析多個(gè)連續(xù)的CpG位點(diǎn)，并提供亞硫酸氫鹽處理的內(nèi)參。

使用PyroMark Assay Design Software，靈活、簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序?qū)嶒?yàn) 

PyroMark Assay Design Software 2.0可簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)PCR和測(cè)序引物。這些產(chǎn)品是經(jīng)過優(yōu)化的，可用于所有的PyroMark儀器。