先將含脫硫生物素的DNA pulldown探針結(jié)合到鏈霉親和素Beads上，再將DNA-Beads和細胞裂解液孵育，這樣DNA結(jié)合蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫液將DNA結(jié)合蛋白從Beads洗脫下來，得到DNA pull down產(chǎn)物。DNA-protein復合物既可以用WesternBlot檢測已知蛋白，也可以用質(zhì)譜鑒定未知蛋白。

 

 

DNA pull-down技術(shù)服務應用背景

DNA pull-down以感興趣的DNA序列為中心，尋找與該序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，最常見的應用是尋找某特定基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

啟動子通常位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游，含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。

轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是一種DNA結(jié)合蛋白，它能夠與真核基因的順式作用元件（如啟動子、增強子等）特異性結(jié)合來激活或抑制基因表達。轉(zhuǎn)錄因子有4個主要結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域決定了轉(zhuǎn)錄因子的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）決定了轉(zhuǎn)錄因子的功能，寡聚化位點使不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用，核定位信號控制轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核。

一個基因的啟動子通常會結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，尋找啟動子序列的特異轉(zhuǎn)錄因子，有助于我們理解這些啟動子下游的功能基因是如何被調(diào)控的。


DNA pulldown技術(shù)實驗服務—客戶案例

 

鼻咽癌的已有研究指出，氯離子通道-3(CLC-3)是一種有應用前景的癌癥生物標志物；但是，CLC-3能否作為胃癌的預后生物標志物以及它在胃癌中的作用機制卻鮮有報道。

 

1 免疫組化實驗表明CLC-3在胃痦組織中高表達，且與患者不良預后有關(guān)

2 RNA-seq分析和細胞實驗發(fā)現(xiàn)敲除CLC-3抑制細胞增殖和遷移，且影響了PI3K/Akt信號通路的很多基因

3 雙熒光素酶實驗確定了CLC-3啟動子的活性區(qū)域

4 DNA pull down MS實驗找到了CLC-3啟動子活性區(qū)域的潛在結(jié)合蛋白XRCC5

5 體內(nèi)DNA探針檢測和ChIP-PCR實驗都確定了XRCC5蛋白可以結(jié)臺CLC-3啟動子

6 免疫組化實驗表明XRCC5和CLC-3的表達呈正相關(guān)，且兩者高表達指示患者預后不良

7 基因表達/敲除和細胞功能實驗結(jié)果顯示CLC-3的表達和功能受XRCC5的調(diào)節(jié)

8 CoIP結(jié)合質(zhì)譜實驗篩選到了XRCC5的互作蛋白PARP1，體內(nèi)DNA探針檢測發(fā)現(xiàn)PARP1也可以與CLC-3啟動子結(jié)合，XRCC5和PARP1協(xié)同調(diào)控CLC-3的表達和功能

9 小鼠移植瘤實驗表明CLC-3在體內(nèi)可也以被XRCC5調(diào)控，影響腫瘤生長

 

CLC-3過表達是胃癌不良預后的生物標志物，并且CLC-3可能通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖和遷移。胃癌中CLC-3過表達的調(diào)控機制是：XRCC5結(jié)合CLC-3啟動子區(qū)并增加其啟動子活性，并且與PARP1相互作用在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控CLC-3的表達。

 

Gu Z.Y. et al: Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. Journal of Hematology & Oncology. 2018. (IF=17.388).
 

輝駿生物提供的DNA pull down實驗技術(shù)服務分以下兩種：

1. DNA Pull down WB，用于檢測目標DNA序列與某樣本中的待測蛋白是否存在相互作用；

2. DNA Pull down MS，用于篩選目標DNA序列與某樣本中的哪些蛋白具有相互作用。

DNA pull down檢測服務
服務項目	服務內(nèi)容	結(jié)果交付	實驗周期	客戶提供	價格
DNA pull-down WB	制備DNA探針	探針電泳圖	5-6周	1、實驗樣本 2、含有目標DNA序列的質(zhì)粒模板及測序文件 3、待測蛋白抗體 4、實驗信息表（樣本信息、抗體信息、目標DNA和待測蛋白序列）	點擊詢價
	Western blot檢測待測樣本中的待測蛋白	Western blot檢測圖
	DNA pull down捕獲目標DNA片段及其結(jié)合蛋白 （2組：實驗組、對照組）	RNA pull down實驗報告
	Western blot檢測DNA Pull down產(chǎn)物中的待測蛋白	Western blot檢測圖
DNA pull-down MS	制備DNA探針	探針電泳圖	8-9周	1、實驗樣本 2、含有目標DNA序列的質(zhì)粒模板及測序文件 3、實驗信息表（樣本信息、目標DNA序列）	點擊詢價
	DNA pull down捕獲目標DNA片段及其結(jié)合蛋白 （2組：實驗組、對照組）	pull down實驗報告
	SDS-PAGE評估DNA pull down產(chǎn)物中的蛋白含量和數(shù)量	SDS-PAGE銀染檢測圖
	LC-MS/MS定性檢測pull down產(chǎn)物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白（潛在互作蛋白）	質(zhì)譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
	針對互作蛋白做生物信息學分析（GO、KEGG pathway、String）	生物信息學分析結(jié)果和報告	1周

DNA pull down實驗服務優(yōu)勢*輝駿生物

1 十年服務經(jīng)驗，客戶成果發(fā)表在Nature Methods，Oncogene，Cell Research等高水平期刊上。

2 對圍繞DNA結(jié)合蛋白開展的整體課題提供全方位指導，包括上下游實驗設(shè)計和結(jié)合蛋白的多方法驗證等。

3 自有蛋白質(zhì)組學平臺，對dna pull down產(chǎn)物這類微量蛋白的質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力，對后續(xù)的生物信息分析有獨到的見解

4 售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確保客戶安心進行下游實驗及投稿。


DNA pull down實驗技術(shù)服務樣本要求
1. 送樣量要求

樣本類型	DNA pull down WB建議送樣量	DNA pull down MS建議送樣量
動物細胞	3*10e7個細胞/組（約3個10cm皿）	5*10e7個細胞/組（約5個10cm皿）
動物組織	1g/組	2g/組
植物葉片	2g/組	4g/組
植物根或果實	4g/組	8g/組
菌體	50ul菌體沉淀/組	100ul菌體沉淀/組

▲注意：這里列出的均為每組樣本的送樣量，如果實驗和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細送樣指南可聯(lián)系輝駿生物客服或銷售索取。
 

（1）樣本用PBS清洗干凈后，離心去掉液體，先放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存；

（2）樣本一定要做好標記，應用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號；

（3）樣本較多或需要分批做，要將樣本分裝；

（4）干冰取樣/運輸；需要至少在送樣前一天通知我方。

 

DNA pull-down實驗服務結(jié)果示例

 

DNA Pull down ms：SDS-PAGE銀染檢測圖

 

DNA pull down-ms：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

 

更多實驗項目請聯(lián)系我們
微信：18927549347
電話：400-699-1663
官網(wǎng)：www.fitgene.com

       廣州輝駿生物科技股份有限公司（原“廣州輝駿生物科技有限公司”）成立于2008年，是一家為科研機構(gòu)提供實驗技術(shù)的專業(yè)公司，尤其擅長于蛋白質(zhì)組學和分子生物學等技術(shù)。經(jīng)過10多的不斷努力與開拓進取，隨著公司規(guī)模不斷擴大，總部已經(jīng)成功入駐廣州黃埔區(qū)科學城國家級科技企業(yè)孵化器。
 

　　經(jīng)過10多的不斷努力與開拓進取，輝駿生物已經(jīng)擁有一支經(jīng)驗豐富、優(yōu)秀刻苦的蛋白質(zhì)組學實驗及蛋白核酸互作技術(shù)隊伍。公司各類實驗的技術(shù)人員均有著深厚的理論基礎(chǔ)和豐富的實驗經(jīng)驗。本公司秉承著嚴謹科學、優(yōu)質(zhì)高效、不斷完善的服務理念，以蛋白質(zhì)組學為中心，函括各類蛋白核酸互作、分子生物學、抗體測序等實驗。面向生物醫(yī)藥企業(yè)、院校、科研機構(gòu)、醫(yī)院和個人，為生物醫(yī)藥研發(fā)、生命科學和醫(yī)學研究提供全方位蛋白質(zhì)組學實驗解決方案。目前，我們已經(jīng)與中科院華南植物研究所、廣州腫瘤醫(yī)院、中山大學、浙江大學、武漢大學、上海海洋大學、西南大學、廈門大學等全國60多家科研單位建立了廣泛的項目合作。
 

 　 感謝多年來廣大客戶對輝駿生物的支持與信任，我們將一如既往地為大家提供優(yōu)質(zhì)、高效、精準的各類包括蛋白質(zhì)組學、核酸蛋白互作、分子\細胞生物學、免疫沉淀試劑盒、抗體測序等著方面實驗技術(shù)服務。本著客戶至上的理念，輝駿生物科技的所有員工將竭誠為您服務，按時按質(zhì)地向您提供各類實驗報告。
 

       歡迎登錄公司網(wǎng)站：www.fitgene.com
       實驗咨詢：  400 699 1663