Pfu DNA Polymerase

GenStar Pfu DNA Polymerase是將克隆有Pyrococcus furiosis的DNA聚合酶基因在大腸桿菌中重組表達(dá)，經(jīng)多次柱層析純化而獲得的高純度、高效率耐熱DNA聚合酶。該酶具有5' →3' DNA聚合酶活性和3' →5' 的外切酶活性(即校讀活性)，能夠糾正DNA擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配現(xiàn)象，適用于對(duì)保真性要求較高的DNA片段的擴(kuò)增，如基因克隆、定點(diǎn)突變、SNP分析等，也可用于DNA片段的末端補(bǔ)平。本產(chǎn)品擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物無(wú)3' 端突出堿基，不可直接用于T載體克隆。

 

 

用途

·   基因克隆、測(cè)序

·   定點(diǎn)突變

 

 

特點(diǎn)

·   高保真性：高純度的酶帶來(lái)優(yōu)于其它品牌的保真性

·   批次穩(wěn)定：遵循標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)

 

 

產(chǎn)品組分

Pfu DNA polymerase (2.5 U/μl)                   100 μl

10 x Pfu Buffer*                                                   1 ml
*含20 mM Mg²⁺

 

 

保存條件

-20℃恒溫保存一年

 

 

活性定義

用活性化的大馬哈魚(yú)精子DNA作為模板/引物，在74℃、30分鐘內(nèi)，攝入10 nmol的全核苷酸為酸性不溶物所需的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。

 

 

10x反應(yīng)緩沖液成分

200 mM Tris HCl (pH 8.8 at 25℃), 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgSO₄, Stabilizer

 

 

質(zhì)量控制

·   以基因組DNA為模板，可以有效地?cái)U(kuò)增2 kb DNA片段，熒光測(cè)序無(wú)突變堿基

·   SDS-PAGE檢測(cè)顯示為一條92 kD的蛋白條帶，純度>98%

·   無(wú)內(nèi)切酶、外切酶污染

·   PCR檢測(cè)無(wú)殘留宿主基因組DNA

·   室溫存放一周無(wú)明顯活性降低

 

 

FAQ:

Q1: 什么時(shí)候需要使用高保真酶?

A1: 凡是對(duì)合成鏈有較高保真性要求的PCR反應(yīng)，如克隆表達(dá)基因、定點(diǎn)突變等，都應(yīng)該采用高保真酶。

Q2: Pfu酶的保真性能如何?

A2: Pfu酶的突變率約為1.3~2.6 x 10^-6，為Taq酶的6倍左右。 

Q3: Pfu酶的擴(kuò)增速率是多少?

A3: Pfu酶擴(kuò)增速率較Taq酶慢，擴(kuò)增1 kb片段需要2分鐘左右。

Q4: Pfu酶能擴(kuò)增多大的片段?

A4: 質(zhì)粒DNA模板最大可擴(kuò)增10 kb，基因組DNA模板上限約為6kb。但通常Pfu酶對(duì)2 kb以上片段的擴(kuò)增效率明顯降低。

Q5: 如何解決Pfu酶擴(kuò)增效率低或擴(kuò)不出的問(wèn)題?

A5: Pfu的擴(kuò)增效率比Taq酶低，特別是以基因組DNA為模板時(shí)。首先要確認(rèn)模板的完整性。如需提高目標(biāo)片段產(chǎn)量，簡(jiǎn)單的方法是在反應(yīng)體系中添加少許Taq酶或PCR增強(qiáng)劑。但此方法只限于擴(kuò)增短片段。擴(kuò)增較長(zhǎng)片段（如4 kb以上），建議使用HiFiTaq DNA polymerase（Cat. No. A116），以確保良好的保真度。 

Q6: Pfu酶擴(kuò)增產(chǎn)物如何進(jìn)行TA克隆?

A6: Pfu催化的PCR產(chǎn)物是平末端，不能直接用于TA克隆。需要用Taq酶做一步加A反應(yīng)，然后才可以克隆到T載體中。克隆Pfu酶擴(kuò)增產(chǎn)物也選用EZ-Blunt平末端載體連接試劑盒 (Cat. No. T170)，直接克隆到經(jīng)過(guò)特殊處理的平末端載體中。

 

 

應(yīng)用實(shí)例

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