今天是第七個(gè)全國科技工作者日（5月30日），神舟十六號(hào)也于上午發(fā)射升空，開啟探索太空新征程。聽說此前神十六發(fā)布會(huì)間隙，作為乘組成員之一的桂海潮還不忘c(diǎn)ue自己的學(xué)生交論文，對(duì)此，有網(wǎng)友戲稱“天地連線開組會(huì)安排上了！”

如果導(dǎo)師出差還要堅(jiān)持開組會(huì)，屏幕前的你會(huì)不會(huì)也為這樣的師生情所感動(dòng)（這里要不要加個(gè)狗頭emoji）然后開始瘋狂趕實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，手里的細(xì)胞挑得飛起，以免導(dǎo)師出其不意問上一句“基因該敲的都敲完了吧？”

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說起基因敲除，很多小伙伴大概總是為課題的這個(gè)問題那個(gè)問題發(fā)愁。眼看年中將近，我們貼心為大家準(zhǔn)備了一系列專場活動(dòng)，本期放出的618分會(huì)場第一波福利中，除互動(dòng)禮品外，還有熱門活動(dòng)「全基因組敲除細(xì)胞構(gòu)建計(jì)劃」，交付單克隆純合子，低至6980元，掃碼即可快速查詢！
 

KO細(xì)胞的常見問題解答 

• 往期回顧

Q1: 基因敲除的sgRNA如何設(shè)計(jì)？
Q2: 如何避免脫靶效應(yīng)？

• 本期內(nèi)容

Q3：CRISPR-Cas9系統(tǒng)的活性檢測方法有哪些?
通常我們都是采用各個(gè)設(shè)計(jì)網(wǎng)站預(yù)測，得到我們的gRNA，那如何能夠快速、準(zhǔn)確的驗(yàn)證CRISPR-Cas9系統(tǒng)是否能發(fā)揮作用呢？

• 熒光活性檢測法。在Cas9和gRNA的作用下，靶點(diǎn)位置的雙鏈DNA會(huì)被切割形成DSB，細(xì)胞通過同源重組形成有活性的熒光蛋白，可通過流式細(xì)胞儀來檢測熒光強(qiáng)度是否增強(qiáng)，以此來判斷Cas9及gRNA的活性及敲除效率。
• 錯(cuò)配酶法。對(duì)修飾后的靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程中，會(huì)形成含有錯(cuò)配的DNA雙鏈，將經(jīng)過錯(cuò)配酶切割后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，檢測CRISPR-Cas9系統(tǒng)的切割活性。
• 套峰檢測法。對(duì)修飾后的靶序列進(jìn)行PCR并測序，通過分析Spacer區(qū)域套峰情況來分析CRISPR-Cas9系統(tǒng)的活性。

Q4：實(shí)現(xiàn)基因功能缺失，我要做敲低（RNAi）還是敲除？

• 當(dāng)敲除可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖非常緩慢或停止生長，或在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的cell pool階段檢測效率呈顯著下降趨勢，即可判定可能出現(xiàn)敲除致死的情況，建議用RNAi。
• 由于存在部分強(qiáng)功能蛋白，即使表達(dá)下調(diào)了，仍然有較強(qiáng)的功能，如果RNAi始終做不出表型，但從有關(guān)信息推測這個(gè)基因很大可能性會(huì)出表型，建議做KO；另外，研究的目的基因處于非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，或者目的基因有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄效率，也是無法用RNAi進(jìn)行有效干擾的，則建議做KO，且KO細(xì)胞更適合進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。
• 最后，敲低跟敲除不是二選一的關(guān)系。當(dāng)我們用RNAi做了基因敲低，觀察到細(xì)胞表型的變化后，仍然可以進(jìn)一步做敲除，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)論更加有說服性。

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• 常見的KO細(xì)胞技術(shù)手段及其對(duì)應(yīng)的技術(shù)原理、技術(shù)特點(diǎn)等
• 移碼突變和片段敲除哪個(gè)能更好地破壞目的蛋白的功能結(jié)構(gòu)域？

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