新品 | 華大智造發(fā)布MGIEasy stLFR文庫(kù)制備試劑盒

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圖1. 華大智造發(fā)布MGIEasy stLFR文庫(kù)制備試劑盒

2018年10月25日，第十三屆國(guó)際基因組學(xué)大會(huì)（簡(jiǎn)稱(chēng)“ICG-13”）在深圳隆重召開(kāi)。華大智造同期舉行“基因組學(xué)技術(shù)與應(yīng)用研討會(huì)”，并在會(huì)上發(fā)布MGIEasy stLFR文庫(kù)制備試劑盒。MGIEasy stLFR文庫(kù)構(gòu)建試劑盒是世界范圍內(nèi)首款基于無(wú)分隔共標(biāo)記方法的長(zhǎng)片段讀取試劑盒，該試劑盒利用高精度短讀序列獲得長(zhǎng)距離信息，融匯二代三代測(cè)序技術(shù)之長(zhǎng)，被譽(yù)為“完美的WGS建庫(kù)”。

該技術(shù)于2018年3月在國(guó)際人類(lèi)基因組大會(huì)(Human Genome Meeting,簡(jiǎn)稱(chēng)HGM)正式發(fā)布，今年10月成功轉(zhuǎn)化為試劑盒產(chǎn)品并發(fā)布�；谌A大智造專(zhuān)利的DNA分子共標(biāo)簽技術(shù)，即將來(lái)源于同一DNA長(zhǎng)片段的短讀測(cè)序片段標(biāo)記上相同分子標(biāo)簽，stLFR實(shí)現(xiàn)了基于高精度短讀測(cè)序獲取長(zhǎng)片段DNA信息（圖2）。與華大智造世界領(lǐng)先的DNBseq™測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，stLFR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高質(zhì)量變異檢測(cè)，二倍體基因組定相，結(jié)構(gòu)變異解析及其他長(zhǎng)讀長(zhǎng)應(yīng)用。

為了讓用戶(hù)第一時(shí)間體驗(yàn)該技術(shù)，華大智造招募首批試用客戶(hù)（可掃描文末二維碼申請(qǐng)）。相比傳統(tǒng)WGS文庫(kù)和其他同類(lèi)產(chǎn)品，stLFR文庫(kù)僅需1 ng DNA且無(wú)需預(yù)擴(kuò)增即可獲得高質(zhì)量的全基因組測(cè)序文庫(kù)；二倍體定相區(qū)塊N50值可達(dá)10 Mb，有效檢出倒位、異位、刪除等結(jié)構(gòu)變異；單管無(wú)分隔反應(yīng)，無(wú)需微量移液設(shè)備或復(fù)雜微流控系統(tǒng)；全部反應(yīng)在磁珠上完成，易于高通量自動(dòng)化建庫(kù)。

圖2. stLFR技術(shù)原理示意圖。該技術(shù)從提取好的長(zhǎng)片段DNA起始，將轉(zhuǎn)座子序列隨機(jī)插入至長(zhǎng)片段DNA中，利用DNA雙鏈互補(bǔ)原理將該產(chǎn)物與帶有多拷貝分子標(biāo)簽的磁珠載體結(jié)合，在引入第二個(gè)接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終完成文庫(kù)構(gòu)建。

stLFR -數(shù)據(jù)表現(xiàn)

長(zhǎng)片段讀取

利用DNA共標(biāo)記方法，MGIEasy stLFR試劑盒可以檢測(cè)分析DNA分子長(zhǎng)度平均長(zhǎng)度可達(dá)50-70 Kb，最大值可超過(guò)300 kb（圖3A）注1。不僅如此，得益于stLFR文庫(kù)超高的分子標(biāo)簽數(shù)，超過(guò)85%的標(biāo)簽內(nèi)有且僅有一個(gè)DNA長(zhǎng)分子（圖3B）注2，這賦予了stLFR文庫(kù)一些可以媲美單分子測(cè)序的數(shù)據(jù)特性。

注1：該數(shù)據(jù)表現(xiàn)決定于初始DNA提取長(zhǎng)度。

注2：該數(shù)據(jù)表現(xiàn)決定于初始DNA投入量和DNA提取長(zhǎng)度。

圖3. stLFR 長(zhǎng)片段讀取特征。（A）片段長(zhǎng)度分布。stLFR文庫(kù)可以檢測(cè)的DNA分子長(zhǎng)度典型值一般為50 Kb左右，最長(zhǎng)可達(dá)300 Kb。（B）每個(gè)標(biāo)簽內(nèi)的長(zhǎng)片段數(shù)量分布。從1 ng DNA起始構(gòu)建stLFR文庫(kù)時(shí)，約有85% 標(biāo)簽內(nèi)有且僅有一個(gè)DNA長(zhǎng)分子。

覆蓋均勻性

從1 ng DNA起始，stLFR文庫(kù)即可獲得與使用100 ng DNA起始的常規(guī)全基因組測(cè)序文庫(kù)相當(dāng)?shù)幕蚪M覆蓋均勻性表現(xiàn)（圖4）。

圖4. stLFR 文庫(kù)測(cè)序深度均勻性。藍(lán)色實(shí)線(xiàn)為stLFR文庫(kù)，綠色虛線(xiàn)為100 ng起始的常規(guī)全基因組測(cè)序文庫(kù)，灰色虛線(xiàn)為理論預(yù)期深度分布（泊松分布），數(shù)據(jù)已均一化至30X覆蓋度。

SNP & InDel檢測(cè)

30X深度下，stLFR文庫(kù)SNP檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（Positive predictive value, PPV）與靈敏度（Sensitivity）均可達(dá)到0.99以上，InDel檢測(cè)F值（F-measure）可達(dá)0.95，整體變異檢測(cè)表現(xiàn)達(dá)到相同深度的常規(guī)全基因組測(cè)序文庫(kù)表現(xiàn)的最佳水平（圖5）。

圖5. stLFR 文庫(kù)30X覆蓋度變異檢測(cè)能力評(píng)估。將stLFR檢測(cè)NA12878樣本的變異結(jié)果與Genome in a bottle（GIAB）提供的高置信區(qū)間檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與靈敏度。

二倍體定相

利用共標(biāo)簽短讀序列，stLFR可以輕松獲得二倍體基因組上雜合位點(diǎn)定相信息，定相區(qū)塊N50值可達(dá)10 Mb以上（圖6）注3，可有效解析基因調(diào)控和編碼區(qū)變異組合。

注3：該數(shù)據(jù)表現(xiàn)共同決定于初始DNA長(zhǎng)度和測(cè)序深度。

圖6. stLFR 定相區(qū)塊在染色體上的分布情況。在40X深度下，stLFR文庫(kù)數(shù)據(jù)定相區(qū)塊N50值可達(dá)34 Mb，雜合位點(diǎn)定相比例高達(dá)99.7%

利用分子標(biāo)簽和長(zhǎng)片段信息，stLFR可以對(duì)多種結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。圖7展示了stLFR對(duì)NA12878中已知的SV進(jìn)行檢測(cè)，檢出率達(dá)到100%。圖8展示了利用stLFR文庫(kù)分別對(duì)攜帶5號(hào)染色體和12號(hào)染色體平衡易位病人樣本（圖8A）和已知2號(hào)染色體染色體內(nèi)倒位的GM20759細(xì)胞系樣本（圖8B）進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。

圖7. 對(duì)NA12878中已知的SV進(jìn)行檢測(cè)，檢出率能達(dá)到100%

圖8. stLFR 文庫(kù)結(jié)構(gòu)變異結(jié)果展示。（A）攜帶5號(hào)染色體和12號(hào)染色體平衡易位病人樣本的stLFR檢測(cè)的分子標(biāo)簽重疊熱度分布圖。（B）已知2號(hào)染色體染色體內(nèi)發(fā)生倒位的GM20759細(xì)胞系樣本分子標(biāo)簽重疊熱度分布圖。

stLFR變異檢測(cè)能力總結(jié)

古語(yǔ)有云，十年磨一劍。華大智造已經(jīng)投入了五年時(shí)間進(jìn)行stLFR技術(shù)的研發(fā)，并且會(huì)繼續(xù)對(duì)該技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)。更多基于stLFR的技術(shù)，如二倍體從頭組裝等，也將陸續(xù)面世。希望在不遠(yuǎn)的將來(lái)，可以通過(guò)stLFR技術(shù)最終實(shí)現(xiàn)完美基因組測(cè)序。

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