基因組編輯技術CRISPR/Cas9自2013年被《科學》列為年度十大科技進展之一后，始終保持高速發(fā)展，在Google學術上，CRISPR/Cas9相關的文獻已經(jīng)超過51700篇。為集中展示國際前沿及國內(nèi)前沿的基因編輯技術，3月30~31日，由北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室主辦的2018基因編輯學術研討會將在京舉行。

 

過去的一年中，基因編輯領域繼續(xù)保持高速發(fā)展，比如：可以終止基因編輯過程的蛋白質被發(fā)現(xiàn)；操縱Cas9的REC3結構域可大幅降低CRISPR-Cas9的脫靶效應；CRISPR基因編輯結合離體器官構建技術可以幫助檢測遺傳性癌癥特異性DNA缺陷；CRISPR裝備噬菌體可以讓“超級細菌”自殺等。

 

2018基因編輯學術研討會將涉及多基因、大片斷基因編輯，單堿基編輯, 在RNA水平進行修復的“REPAIR”系統(tǒng)，基因編輯抑制劑與CRISPR/Cas9的配合，如何降低CRISPR/Cas9的脫靶效應，不依賴于DNA雙鏈斷裂的新型腺嘌呤堿基編輯器，利用CRISPR/Cas9技術開發(fā)新型藥物篩選工具等主題，眾多一線科研工作者將聚集于此共襄學術盛宴。

 

2018年3月30 上午
周德敏	北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室	Manipulation of Viral Genome in Conversion of Life-Threatening Viruses as Precision Therapeutics
王艷麗	中科院生物物理研究所	Cas13a切割RNA的分子機制
吳強	上海交通大學	開發(fā)DNA大片段編輯技術研究染色質高級結構
魏文勝	北京大學生命科學學院	High-throughput functional genomics
王永明	復旦大學	建立高效的CRISPR/Cas9編輯技術
2018年3月30 下午
楊輝	中科院上海生科院神經(jīng)科學研究所	基因編輯在疾病模型建立及疾病治療中的應用
常興	上海生命科學研究院	利用靶向性胞嘧啶脫氨酶進行基因編輯
陳崇	四川大學生物治療國家重點實驗室	基因編輯在腫瘤機制研究中的應用
黃強	復旦大學生命科學學院	CRISPR-Cas9的DNA剪切活性結構研究
2018年3月31 上午
裴端卿	中科院廣州健康研究院	基因編輯技術在人口健康領域的應用（暫定）
馬燕琳	海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院	基因編輯與生殖健康
周峰	復旦大學生物醫(yī)學研究院	利用dcas9和超高靈敏度蛋白質譜平臺構建位點特異DNA-蛋白質互作網(wǎng)絡
高紹榮	同濟大學生命科學與技術學院	Generation of animal models for studying human reproduction failure
朱潔	廣州市婦女兒童醫(yī)療中心	CRISPR-Cas9介導的光感受器細胞重編程治療視網(wǎng)膜色素變性
2018年3月31 下午
朱健康	中科院上海生科院植物逆境生物學研究中心	植物基因組編輯技術的開發(fā)和應用
牛昱宇	昆明理工大學	靈長類基因編輯與疾病模型的研究
王皓毅	中科院動物研究所	CRISPR-Cas9在動物模型構建、T細胞治療以及基因表達調控中的應用
張淑君	華中農(nóng)業(yè)大學	建立和利用豬全基因組基因敲除CRISPR/Cas9技術篩選鑒定豬流感病毒感染相關的宿主（豬）基因

 

 

CRISPR-Cas9在動物模型構建、T細胞治療以及基因表達調控中的應用
高效精確的基因工程技術對于發(fā)展基因治療，建立細胞和動物疾病模型具有極為重要的價值。近年來特異性定點核酸酶的研究取得了長足的進步。為了突破傳統(tǒng)基因打靶方法的局限，我們率先通過受精卵注射CRISPR-Cas9一步獲得多基因敲除的小鼠。為了取代低通量且技術要求極高的顯微注射技術，我們建立了受精卵電擊的方法，從而極大簡化了動物模型的構建。這一系列工作大大提高了基因修飾小鼠構建效的率和速度，為疾病和發(fā)育生物學的體內(nèi)研究提供了重要的工具。同時我們在原代T細胞和表達嵌合性抗原受體的T細胞（CART）中建立了高效的單基因和多基因敲除技術，為細胞免疫治療研究提供了工具。除了基因編輯，我們也基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立了新技術，用來調控基因的表達水平和表觀遺傳修飾狀態(tài)。

 

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物抗免疫防御系統(tǒng)，是近年來發(fā)現(xiàn)的由小分子RNA介導的免疫系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類，Cas13a是第二大類VI型系統(tǒng)中的效應蛋白，亦稱C2c2，具有RNA介導的RNA酶切活性，是目前第二大類CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的唯一能夠降解RNA的蛋白，在RNA技術中具有潛在的應用價值，對開發(fā)研究RNA工具，擴展CRISPR系統(tǒng)在基因編輯方面的運用具有重大價值。
為了研究Cas13a如何被激活來切割RNA，我們解析了與crRNA及其靶RNA結合的Leptotrichia buccalis（Lbu）Cas13a的晶體結構，以及LbuCas13a-crRNA復合物的cryo-EM結構。研究結果揭示了crRNA-靶RNA雙鏈體結合在核酸酶（NUC）葉片的帶正電的中心通道中，并且Cas13a蛋白和crRNA在靶RNA結合后發(fā)生顯著的構象變化。指導目標RNA雙鏈體形成觸發(fā)HEPN1結構域向HEPN2結構域移動，激活Cas13a蛋白的HEPN催化位點，其隨后以非特異性方式裂解單鏈靶標和旁系RNA。研究結果證實target RNA的結合導致LbuCas13a的兩個HEPN結構域發(fā)生構象變化，從而激發(fā)LbuCas13a非特異性地切割任意單鏈RNA的酶切活性，該成果為研究Cas13a發(fā)揮RNA酶活性的分子機制提供了重要的結構生物學基礎。該研究的發(fā)現(xiàn)為CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的進一步開發(fā)提供了可靠的結構基礎，對深入理解細菌抵御病毒入侵的分子機制提供了強有力的證據(jù)，并將對病毒引起的疾病的預防、檢測、控制與治療產(chǎn)生重大意義，特別是基于Cas13a高效的RNA酶切活性，對其應用于各類重大疾病的快速檢測具有十分廣闊的前景。

 

開發(fā)DNA大片段編輯技術研究染色質高級結構
源于細菌和古菌的Ⅱ型成簇規(guī)律間隔短回文重復系統(tǒng)[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9]近年被改造成為基因組定點編輯的新技術。由于它具有設計簡單、操作方便、費用低廉等巨大優(yōu)勢，給遺傳操作領域帶來了一場革命性的改變�；�于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組DNA片段靶向編輯技術主要包括DNA片段的刪除、反轉、重復、插入和易位等，這一有效的DNA片段編輯方法為研究基因功能、調控元件、組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展提供了有力手段。我將著重匯報我們在該領域最新的研究CTCF等染色質架構蛋白在三維基因組組裝調控的進展，為開展利用基因組DNA片段靶向編輯進行基因調控和功能研究提供參考。

 

Manipulation of Viral Genome in Conversion of Life-Threatening Viruses as Precision Therapeutics
The conversion of life-threatening viruses into live but avirulent vaccines represents a revolution in vaccinology. In a proof-of-principle study, we expanded the genetic code of the genome of influenza A virus via a transgenic cell line containing orthogonal translation machinery. This generated premature termination codon (PTC)–harboring viruses that exerted full infectivity but were replication-incompetent in conventional cells. Genome-wide optimization of the sites for incorporation of multiple PTCs resulted in highly reproductive and genetically stable progeny viruses in transgenic cells. In mouse, ferret, and guinea pig models, vaccination with PTC viruses elicited robust humoral, mucosal, and T cell–mediated immunity against antigenically distinct influenza viruses and even neutralized existing infecting strains. The methods presented here may become a general approach for generating live virus vaccines that can be adapted to almost any virus.

 

建立高效的CRISPR/Cas9編輯技術
CRISPR/Cas9是一項革命性的基因編輯技術，得到廣泛應用。我們從兩個方面著手提高CRISPR/Cas9的編輯效率。我們利用附著體載體表達Cas9和gRNA，稱之為epiCRISPR技術。附著體載體不整合到基因組，但是可以隨著細胞的分裂而復制，因而可以長期的表達外源基因，實現(xiàn)長期的基因編輯。同時在附著體載體上表達嘌呤霉素抗性基因，可以富集轉染成功的細胞。編輯完成后撤除篩選藥物，附著體質粒迅速丟失，編輯后的細胞不再表達外源基因。利用附著體技術可以實現(xiàn)高達100%編輯效率，還可以高效的敲除基因組大片段，以及同時敲除多個基因。CRISPR/Cas9編輯效率受gRNA序列影響，不同的gRNA效率差別很大，測試gRNA效率費時費力。我們建立了高通量的測試gRNA活性的方法，得到了5萬多條gRNA的活性，覆蓋了2萬多個人類基因。這些工作將會極大的方便基因編輯工作。

 

利用靶向性胞嘧啶脫氨酶進行基因編輯
單核苷酸的多樣性是遺傳多樣性的主要來源，是人類個體差異的重要遺傳學基礎，同時也是分子進化的動力和很多疾病的直接誘因。然而，在哺乳動物中，仍然缺乏有效誘導單核苷酸的突變的工具，無法通過實驗高效和高通量的地研究單核苷酸突變的功能。現(xiàn)有的大部分實驗技術只能擾亂基因的功能或者表達，造成基因功能缺失，對誘導新功能的獲得無能為力。而利用靶向性胞嘧啶脫氨酶介導的堿基編輯（Targeted AID-mediated mutagenesis ,TAM）技術，可以在sgRNA靶向的基因組DNA上，將胞嘧啶和鳥嘌呤隨機地向其它三個堿基轉變，因而產(chǎn)生海量的突變體，結合遺傳篩選，從而分析單核苷酸突變的功能或誘導蛋白質的體內(nèi)進化。同時在一種多肽抑制劑（UGI）的輔助下，dCas9-AID可以誘導特定的胞嘧啶向胸腺嘧啶轉變，實現(xiàn)單堿基的精確編輯，為治療單核苷酸突變誘導的遺傳病提供方案。利用這項技術，已經(jīng)在慢性骨髓瘤細胞中，成功篩選出已報道的以及新的imatinib耐藥性位點。因此，作為高效的哺乳動物DNA堿基編輯新技術，TAM可以廣泛應用于蛋白質工程，分子遺傳學研究和基因治療等領域。

 

基因治療已經(jīng)在多種人類疾病治療中顯示出巨大的潛能。然而目前的方法通常只針對單個基因或單個突變，使得對多基因或多點突變的疾病治療受到極大限制。視網(wǎng)膜色素變性是臨床常見的致盲眼病，極具臨床和遺傳異質性，是導致人類視力障礙最主要的疾病之一。目前已有超過40個基因和位點被報道與視網(wǎng)膜色素變性有關。這里我們采用CRISPR/Cas9介導的基因編輯方法，對視網(wǎng)膜色素變性小鼠進行了基因治療。通過突變視桿細胞中重要的轉錄因子Nrl或Nr2e3，將視桿細胞重編程為視錐細胞。轉化后的視錐樣細胞對突變引起的感光細胞退化不敏感，從而使小鼠在發(fā)病后期仍能保留一定程度的視力。我們的發(fā)現(xiàn)不僅為視網(wǎng)膜色素變性提供了新的不依賴于基因突變的治療方法，而且證明了基因編輯技術介導的細胞重編程、細胞退化預防以及組織功能保護的巨大可能性。

 

基因修飾動物是研究在發(fā)育和疾病中基因功能的重要工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效的應用于構建基因敲除和敲入小鼠。然而，該方法獲得的基因修飾動物存在嚴重的嵌合體現(xiàn)象，即動物個體的一部分細胞被基因編輯，而另一部分則沒有。通過交配方法獲得純合的基因敲除小鼠需要很長的時間和花費，這在獲得多基因敲除小鼠中尤為明顯。而由于猴子的生殖周期長（4-5年性成熟，半年懷孕期），生殖能力低（單胎動物），通過交配方法來獲得純合突變的基因修飾猴則需要更長的時間和花費。為此，我們通過優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功的在第一代就獲得了單基因或多基因功能完全敲除的小鼠及猴，可以直接用于表型分析，極大促進了非人靈長類動物模型的建立及其在腦科學及腦疾病中的研究。同時我們設計了一種同源介導末端接合（HMEJ）策略，可以在分裂和非分裂細胞中均實現(xiàn)精確且高效的基因整合。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎或者體內(nèi)的肝細胞和神經(jīng)元中，該方法的效率均遠高于以HR、NHEJ和MMEJ為基礎的策略。因此，這種HMEJ策略可能具有多種運用性，譬如基因編輯來獲得動物模型以及靶向基因治療。
通過上述幾種方法，我們可以有效的在猴中獲得各種基因修飾猴模型。近期，我們目標獲得的疾病猴模型包括PD，AD，ALS，DMD，RP，AS等，工具猴模型包括光遺傳猴，各種神經(jīng)元特異的Cre猴等。這些猴模型的建立將極大促進我們對人類疾病的了解和治愈。
此外，我們也致力于各種CRISPR相關工具的開發(fā)及優(yōu)化，包括CRISPR激活系統(tǒng)，CRISPR標記系統(tǒng)，CRISPR介導的成體治療等等。

 

基因編輯技術通過插入、缺失或替換的手段對基因組進行定點改造，既能夠通過以突變基因代替正�；�因來研究基因的功能，也能夠以正�；�因代替突變基因來進行基因治療。近年來，有著“基因剪刀”之稱的CRISPR/Cas9技術被認為是能夠在活細胞中快速、準確地編輯目的基因的有效方法。隨著人類在破譯基因的遺傳密碼和基因編輯技術上的不斷突破，通過修改基因從根本上治愈和預防疾病成為可能，特別是在單基因疾病的治療上，基因編輯有著廣闊的運用前景。就生殖健康方面而言，卵巢早衰這類由表觀遺傳引起的疾病目前只能通過替代治療延緩癥狀，不能根治。CRISPR/Cas9技術的出現(xiàn)有望對表觀遺傳的靶點進行遺傳編輯，改善生殖健康，也為生殖相關疾病提供了新的治療思路。此外，利用基因編輯對胚胎特定基因集進行敲除操作，造成相應基因在胚胎中的缺失，可深入研究人類胚胎早期發(fā)育中的功能、作用機理，幫助人類了解生物體的基本功能，也可以推動人類健康事業(yè)的發(fā)展,從根源上清除遺傳疾病。

 

在豬PK15細胞系中，證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬細胞系中能高效地誘導豬基因敲除。設計和構建了豬全基因組基因敲除CRISPR/Cas9文庫，該文庫包含了65316個gRNAs、覆蓋了13229個基因，其中含有5個gRNAs的基因有11400個基因、含有4個gRNAs的基因有1829個，并且全部的基因都含有至少2個gRNAs（最多不超過5個gRNAs/基因）。利用該豬全基因組基因突變gRNAs文庫進行大規(guī)模的基因篩選，初步篩選出了140個候選宿主基因，并證實了其中的32個候選基因在病毒復制增殖中具有一定的調控作用

 

利用dcas9和超高靈敏度蛋白質譜平臺構建位點特異DNA-蛋白質互作網(wǎng)絡
隨著功能基因組學的飛速發(fā)展，對調控基因表達的順式（cis-）和反式(trans-)作用元件進行系統(tǒng)研究成為當前急需填補的領域空白。利用生物素化的（biotinylated）功能缺失的dcas9系統(tǒng)加上能與我們所感興趣位點能夠形成特定結合的SgRNA，在原位去分離純化我們感興趣位點DNA以及與這個位點有特定結合的蛋白質復合物。我們利用該系統(tǒng)去研究在白血病細胞系K562中，與血紅蛋白（Hemoglobin）的幾個亞型HBB、HBG、HBE1、以及與調控相關的幾個重要的增強子HS1、HS2、HS3、HS4和HS5 上面所結合的蛋白質復合物。在該實驗中，我們利用Streptavidin的免疫特異性樹脂球對帶有Biotin基團的蛋白質復合物進行純化。然后進行了iTRAQ的標記，最后，樣品由高靈敏度的全蛋白定量平臺進行定量的分析。在該實驗中，我們能夠檢測到如GATA1，TAL1，NFE2等與血紅蛋白的表達息息相關的已知的轉錄因子。與此同時，我們也能發(fā)現(xiàn)新的蛋白質核孔蛋白NUP98以及NUP153結合在hemoglobin基因的位點上面。然后，我們利用該方法研究了跟疾病關系密切的位點，HBE1到HBD之間的區(qū)域。通過蛋白質組學，我們發(fā)現(xiàn)與HBD-1K相結合的蛋白質的數(shù)量要多于與HBD-1.5K以及HBD-2K的蛋白我們同時也測定了與這些位點有相互作用的DNA區(qū)域，我們也同樣發(fā)現(xiàn)與HBD-1K相結合的DNA的數(shù)量要多于與HBD-1.5K以及HBD-2K的DNA數(shù)量。綜合以上的證據(jù)，HBD-1K是一個重要的疾病相關基因，通過CRISPR技術敲除了HBD-1K之后，我們能夠發(fā)現(xiàn)HBG的基因轉錄受到了明顯的影響，而HBB的轉錄則大致不變。我們的技術表明了，我們能對特定的DNA區(qū)域，即使是對單拷貝的DNA位點能夠進行全面深度的蛋白質復合物的解析。這些解析的結果能夠幫助我們發(fā)現(xiàn)那些對特定基因起著重要調控作用的蛋白質，對研究這些基因的激活與靜默機制有著至關重要的作用。

 

更多精彩，期待現(xiàn)場                                              

 

時間：2018年3月30-日~3月31日   

地點：北京維也納國際酒店(北京廣安門店)  北京 西城區(qū) 白廣路7號

主辦單位：北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室  

大會主席：周德敏教授

會議官網(wǎng)：http://www.acadeevent.com/geneediting/index.html

 

 

張依寒    

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