關(guān)注臨床應(yīng)用，454推出HLA分型檢測研究產(chǎn)品                               
—Julia Karow，2011-4

      

        2011-4，Roche 旗下454生命科學(xué)推出了高分辨率和中等分辨率的HLA基因分型試劑盒。

       人類白細(xì)胞抗原（HLA）所在位點(diǎn)編碼超過200個(gè)基因，在免疫系統(tǒng)中有著關(guān)鍵作用。HLA具有高度多態(tài)性，包括約6000個(gè)已知的等位基因。HLA基因型與自身免疫、傳染疾病以及一些癌癥都有聯(lián)系，此外HLA分型對(duì)器官移植中的供體和受體配型也有重要作用。

        454的兩套試劑盒，即GS  GType HLA MR 和 HR，目前只能用于研究。它們是454分析系列計(jì)劃里第一個(gè)應(yīng)用于疾病領(lǐng)域的產(chǎn)品，未來產(chǎn)品系列中還將包括免疫遺傳學(xué)、傳染病以及癌癥。

        據(jù)公司介紹，相對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger法測序，基于454測序技術(shù)平臺(tái)的HLA分型，擁有更高的通量，每次運(yùn)行（run）可平行處理5－80個(gè)樣品；以及可以精確的對(duì)目的外顯子區(qū)域進(jìn)行高覆蓋度的測序，從而得到樣本間的多態(tài)性數(shù)據(jù)，從而節(jié)省了時(shí)間和勞力。      

        454 CEO Chris McLeod指出，HLA分型僅在疾病研究中就“大有作為”，在法醫(yī)、群體遺傳學(xué)等其它領(lǐng)域，也有發(fā)展?jié)摿�。他提到，目前的分辨率水平�?duì)于許多研究應(yīng)用都是非常有益的，今后要做的就是在這個(gè)基礎(chǔ)上開發(fā)有潛力的注冊產(chǎn)品，應(yīng)用于臨床。

        Roche公司還未宣布何時(shí)計(jì)劃向美國食品和藥物部門提交應(yīng)用申請(qǐng)，但是，Chris McLeod 也指出旨在提交的測序平臺(tái)及其分析的申請(qǐng)也是基于現(xiàn)行的研究版本。許多HLA分型的臨床應(yīng)用中，分析的分辨率都要求比現(xiàn)在的更高。臨床上的測序平臺(tái)“不會(huì)是全新的，”而是當(dāng)前最穩(wěn)定的。

        McLeod指出目前臨床HLA分型主要是Sanger 測序法，雖然還沒有注冊的診斷產(chǎn)品存在，但對(duì)于454也是個(gè)“目標(biāo)市場”。

        上個(gè)月，Life Technologies宣布已開始使用一款Sanger 毛細(xì)血管測序儀即3500 Dx遺傳分析儀進(jìn)行了HLA分型的臨床試驗(yàn)，并計(jì)劃向FDA（CSN 3/22/2011）申請(qǐng)510（k）平臺(tái)空間及分析試劑盒。

        McLeod指出臨床HLA檢測將會(huì)是454的市場，“在這個(gè)領(lǐng)域，我們比Sanger 測序有著顯著的優(yōu)勢。”與其它的二代測序平臺(tái)相比，454相對(duì)的長讀長對(duì)準(zhǔn)確確定等位基因相位更有用�！坝捎谄渌�平臺(tái)的讀長不足夠長，因此實(shí)際中他們需要做許多工作，”他說。454和羅氏與合作研究者已進(jìn)行了HLA分析檢測，并于上個(gè)月在Tissue Antigens公布了研究結(jié)果，其中合作機(jī)構(gòu)包括斯坦福大學(xué)、德國德累斯頓技術(shù)大學(xué)、費(fèi)城兒童醫(yī)院、奧地利紅十字輸血服務(wù)、奧克蘭兒童醫(yī)院和研究中心以及德國凱撒斯勞滕免疫及遺傳學(xué)協(xié)會(huì)。

        奧克蘭兒童醫(yī)院和研究中心HLA & Immunogenetics實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人,也是文章作者之一，Elizabeth Trachtenberg 談到454平臺(tái)一個(gè)主要優(yōu)勢，就是減少等位基因雜合子對(duì)計(jì)算多態(tài)性頻率的影響。而使用 Sanger 測序，“我們必須做許多補(bǔ)充測驗(yàn)去解決這些模糊的雜合子組合，而這個(gè)新的克隆法測序大大簡化了該問題，”她這樣告訴Clinical Sequencing News,“ 我們至少要花費(fèi)四分之一的時(shí)間去解決含糊性，而454平臺(tái)確實(shí)給HLA臨床試驗(yàn)提供了很大的幫助”。 每個(gè)樣品的成本也“明顯少于Sanger測序法，”她補(bǔ)充到，因?yàn)樵S多樣品可以平行操作，同時(shí)模糊性被降低，盡管她還沒有完全精確計(jì)算成本，目前她的實(shí)驗(yàn)室每次同時(shí)進(jìn)行40個(gè)樣品11個(gè)位點(diǎn)的測序。

        可以肯定的是，雖然Trachtenberg的 454 GS FLX是在CLIA實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行，但它不是用于臨床工作而僅是疾病研究�！暗�是隨著時(shí)間推移，我們將來會(huì)把它應(yīng)用于臨床試驗(yàn)和處理病人樣品，”她說，甚至可能在FDA同意454儀器之前。倘若不能使用羅氏的試劑盒進(jìn)行臨床研究，她可能自己研發(fā)試劑。

 

        兩年前，一些HLA檢測實(shí)驗(yàn)室一直懷疑使用454平臺(tái)進(jìn)行臨床HLA分型，復(fù)雜且工作量大的樣本準(zhǔn)備，讀長有限而不能進(jìn)行外顯子之間的多態(tài)性分析，此外還需要在一次運(yùn)行中集合許多樣本，以使得分析在成本上更高效(IS 3/17/2009)。

        McLeod表明，公司已和使用者合作研究液態(tài)控制系統(tǒng)，自動(dòng)化準(zhǔn)備樣本。此外，兩年前引入 Titanium chemistry技術(shù)后，讀長增至約400 bp。最后還引入GS  Juinor，單次運(yùn)行需要準(zhǔn)備的樣品數(shù)目也減少了。

        每個(gè)454的HLA分析研究都包括一個(gè)用于PCR擴(kuò)增的引物，可同時(shí)擴(kuò)增多達(dá)10個(gè)HLA基因的1-3個(gè)外顯子，以及糾錯(cuò)軟件和優(yōu)化測序數(shù)據(jù)的第三方軟件。試劑盒提供4塊含干粉引物的PCR微量滴定板，每個(gè)可用于10個(gè)樣品測定。10個(gè)樣品進(jìn)行中等分辨率分析需要一個(gè)板，而高分辨率分析則要求兩塊板。

        無論GS FLX或GS junior, PCR擴(kuò)增子都是可直接對(duì)接454測序樣品準(zhǔn)備的工作流程中。對(duì)于中等分辨率，GS FLX 每次可進(jìn)行80個(gè)樣品的分析，GS junior每次可進(jìn)行10個(gè)樣品的分析。對(duì)于高分辨率， FLX 每次可分析40個(gè)樣品的， Junior每次可分析5個(gè)樣品。

         除了HLA檢驗(yàn)，454還有一些其他的靶位測序分析的發(fā)展空間，Mcleod表示454將會(huì)在人類健康護(hù)理方面有很大作用，包括許多特殊疾病。每一種都將由一套優(yōu)化的引物和軟件組成。454計(jì)劃這些疾病相關(guān)的檢測將定期發(fā)布，約每3到6個(gè)月推出一次，其中許多檢測將來在臨床環(huán)境下非常有潛力。

 

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