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Amersham™ ECL™Prime
蛋白印跡試劑

自從1990年進(jìn)入市場(chǎng)以來(lái)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）蛋白印記系統(tǒng)產(chǎn)品庫(kù)不斷豐富，以適應(yīng)從常規(guī)蛋白檢測(cè)到采用基于熒光Amersham ECL™plex進(jìn)行多道分析的各種應(yīng)用。通過(guò)選擇ECL檢測(cè)系統(tǒng)，研究人員不僅可以避開(kāi)對(duì)人有危害的放射性同位素操作，同時(shí)還擁有了另外的分析工具，正是由于這種分析具有一次性的特點(diǎn)，使得蛋白分析比以前變得更加快速，更加敏感，也更加地靈活。

Amersham ECL家族最近加入的成員是ECL prime，它至少具有ECL plus兩倍的敏感性，其最低檢測(cè)限（LOD）可達(dá)低皮克量級(jí)。該試劑的特點(diǎn)在于大幅增加了信號(hào)的穩(wěn)定性，這使得反復(fù)曝光變成可能，并使其能在一個(gè)試驗(yàn)中輕松地進(jìn)行多個(gè)印記處理。此外，ECL prime所發(fā)射的信號(hào)強(qiáng)度提高了3到5倍，這也就 意味著ECL prime也采用比ECL plus低3倍的一抗和二抗進(jìn)行檢測(cè)，這不僅降低了背景，并使抗體試劑的費(fèi)用得到降低。

ECL Prime保留并增強(qiáng)了Amersham ECL plus和Amersham ECL Advance™的優(yōu)勢(shì)，提供出一套敏感、穩(wěn)定、在很寬蛋白動(dòng)態(tài)水平范圍內(nèi)能精確定量并在節(jié)省昂貴的抗體試劑成本的檢測(cè)系統(tǒng)：
  • 信號(hào)強(qiáng)度高且靈敏，允許使用高度稀釋的一抗和二抗而 不降低靈敏度
  • 信號(hào)穩(wěn)定，可重復(fù)曝光，非常適合大量實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，客戶可以從容地安排實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)之間的時(shí)間
圖1. Amersham ECL Prime：GE Healthcare的一種新的、高靈敏化 學(xué)發(fā)光蛋白印記試劑。
  • 最適合于ImageQuant™LAS 4000（CCD成像）成像，也 可與Amersham Hyperfilm匹配使用
  • 可與Rainbow™分子量標(biāo)準(zhǔn)和Amersham ECL Dualvue™蛋 白印記標(biāo)準(zhǔn)配合使用
  • 最適合選用Amersham Hybond™-P（PVDF）膜，也可使 用Amersham Hybond-ECL（硝酸纖維）膜

圖2.ECL prime與偶聯(lián)在二抗上的HRP之間的反應(yīng)。HRP可催化ECL prime試劑向感光分子轉(zhuǎn)化，感光分子被氧化產(chǎn)生受激產(chǎn)物，受 激產(chǎn)物衰變時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)。

化學(xué)發(fā)光蛋白檢測(cè)
ECL prime可檢測(cè)出蛋白印記實(shí)驗(yàn)中極微量的蛋白質(zhì)。信號(hào)為發(fā)射光（化學(xué)發(fā)光，見(jiàn)圖2），其信號(hào)強(qiáng)度與檢測(cè)蛋白量成正比，可以給出單次印記在很寬蛋白水平范圍的精確數(shù)據(jù)。

辣根過(guò)氧化物酶（HRP）可催化魯米諾發(fā)生氧化，從而產(chǎn)生425 nm波長(zhǎng)的化學(xué)發(fā)光。與其他化學(xué)發(fā)光試劑相比，ECL prime在實(shí)際中加入了增強(qiáng)劑，可以增加酶活力，從而大幅提高了信號(hào)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。通過(guò)加入催化劑可以進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)。

 

Amersham ECL Prime在蛋白免疫印跡中的應(yīng)用

ECL Prime主要在蛋白免疫印跡流程的檢測(cè)階段發(fā)揮作用（圖3），同時(shí)對(duì)上游的步驟也有一定的影響。比如， ECL Prime作為檢測(cè)方法時(shí)可以采用高度稀釋的一抗作為與免疫 印跡膜雜交的探針。這不僅在經(jīng)濟(jì)上非常合適，也避免了背景信號(hào)下淹埋的與目的蛋白之間的較弱特異結(jié)合。ECL的高靈敏度要求其不僅能封閉非蛋白結(jié)合位點(diǎn)，并且能被清洗步驟徹底清除。

圖3.蛋白印記流程中的ECL Prime。圖中所列為最典型的蛋白印記實(shí)驗(yàn)。某些特定步驟附加的產(chǎn)品來(lái)自GE Healthcare產(chǎn)品庫(kù)，提供整個(gè)蛋白印記流程的解決方案，所有產(chǎn)品都經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以配合使用。

Amersham ECL prime：性能特點(diǎn)
靈敏度和精確度

與ECL plus相比，ECL prime更加靈敏，且在很寬的蛋白水平范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性信號(hào)響應(yīng)。圖4結(jié)果為加ECL prime 75秒后曝光以及加ECL Plus 3分鐘后曝光。結(jié)果表明ECL prime在靈敏度方面增加了4倍（見(jiàn)圖4的LOD），且線性動(dòng)態(tài)范圍有明顯的改善，這使得同一印跡膜上無(wú)論高或低豐度的蛋白都能在單次曝光后被檢測(cè)出來(lái)并精確定量。

樣品： 對(duì)2.5 ng轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行2倍梯度稀釋
膜： Amersham Hybond-p
封閉： ECL prime封閉劑(ECL prime)和5%脫脂干奶粉(ECL plus)
一抗： 兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白(1:3000)
二抗： HRP偶聯(lián)的抗兔IgG(1:30000)
檢測(cè)： Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus
成像： ImageQuant LAS 4000 mini(其中Amersham ECL prime成像需要75秒， Amersham ECL plus成像需要3分鐘)
LOD： 2.4 pg(ECL prime)，9.8 pg(ECL plus)
動(dòng)態(tài)范圍(DR)： 3個(gè)數(shù)量級(jí)(ECL prime), 2.4個(gè)數(shù)量級(jí)(ECL plus)
圖4.分別用ECL prime（上欄）和ECL Plus（下欄）對(duì)2倍梯度稀
釋的轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)。樣品印跡在Amersham
Hybond-p（PVDF）膜上，并通過(guò)ImageQuant LAS 4000 mini系統(tǒng)
進(jìn)行成像。

信號(hào)穩(wěn)定性

ECL prime產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)非常穩(wěn)定，即使對(duì)于所檢測(cè) 的最小量的蛋白質(zhì)，其信號(hào)依然能在加入試劑后三小時(shí)內(nèi)維持足夠強(qiáng)度，這使得重復(fù)曝光成為可能，并且能在每次實(shí)驗(yàn)和分析之間輕松地安排時(shí)間（圖5和表1）。

經(jīng)過(guò)ECL prime處理1小時(shí)后，大約還剩下60%的信號(hào)，而
ECL plus處理則只剩下15%。

樣品： 對(duì)2.5 ng轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行2倍梯度稀釋
膜： Amersham Hybond-p
封閉： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中
一抗： 兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白(1:3000)
二抗： HRP偶聯(lián)的抗兔IgG(1:30000)
檢測(cè)： Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus
成像： ImageQuant LAS 4000 mini(所有時(shí)間點(diǎn)都進(jìn)行3分鐘成像)

圖5.加入ECL prime 3小時(shí)內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行并排比較。同時(shí)對(duì)ECL試劑處理相同時(shí)間的效果進(jìn)行比較。

表1.試劑加入后3小時(shí)內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的殘留信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)每組中第4條帶（0.312 ng轉(zhuǎn)鐵蛋白）進(jìn)行分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)曝光時(shí)間為3分鐘。

 

有效利用抗體

使用ECL prime可以檢測(cè)到ECL plus檢測(cè)不到的更低的蛋白量，即使一抗經(jīng)過(guò)高度稀釋，這種可能性仍然存在（圖6）。ECL prime中采用1:10000（一抗）和1:50000（二抗）的抗體稀釋與ECL plus采用1:3000和1:30000的抗體稀釋所得到的信號(hào)強(qiáng)度和LOD類似。

樣品： 對(duì)10 μg的NIH 3T3細(xì)胞裂解總蛋白進(jìn)行2倍梯度稀釋
膜： Amersham Hybond-P
封閉： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中
一抗： 兔抗β-catenin(1:3000到1:10000)
二抗： HRP偶聯(lián)的抗兔IgG(1:30000到1:50000)
檢測(cè)： Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus
成像： ImageQuant LAS 4000 mini(一抗1:3000或1:5000稀釋時(shí)需5分鐘，一抗1:7000或1:10000稀釋時(shí)需7分鐘)

圖6.對(duì)ECL prime和ECL plus在NIH 3T3全細(xì)胞裂解物來(lái)源的2倍梯度 稀釋樣品，采用不同稀釋倍數(shù)的兔抗β-catenin和HRP偶聯(lián)的抗兔IgG進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)時(shí)的效果進(jìn)行比較。

 

產(chǎn)品兼容性

Amersham ECL Prime經(jīng)過(guò)改良，配合GE Healthcare的蛋白印記套餐產(chǎn)品使用，可發(fā)揮出最佳的性能，例如Amersham Hybond-p膜。當(dāng)然，Amersham ECL prime也能與其他蛋白免疫印跡試驗(yàn)中常用的試劑匹配使用。例如，使用硝酸纖維Amersham Hybond-ECL膜同樣能獲得不錯(cuò)的效果，此外對(duì)于ECL prime使用，不需要特殊推薦某種分子量標(biāo)準(zhǔn)或封閉試劑。

 

細(xì)胞裂解物中不同靶蛋白水平的相對(duì)定量

具有高度靈敏的ECL prime試劑配合具有極寬動(dòng)態(tài)范圍的 CCD成像儀如ImageQuant LAS 4000 mini，在同一次印記中通過(guò)非調(diào)節(jié)管家蛋白進(jìn)行標(biāo)化，可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行可信度極高的相對(duì)定量（圖7）。通過(guò)檢測(cè)管家蛋白的表達(dá)水平，可以判斷每一泳道是否加入了相似量的總細(xì)胞裂解物。

樣品： 10 μg的NIH 3T3細(xì)胞裂解物(IFNa處理/不處理細(xì)胞以一定比例混合)或Hela細(xì)胞裂解物(茴香霉素處理/不處理細(xì)胞以一定比例混合)總蛋白膜： Amersham Hybond-p
封閉： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中
一抗： 兔抗β-catenin(1:3000)，小鼠抗pSTAT3(1:3000)或小鼠抗肌動(dòng)蛋白(1:3000)
二抗： HRP偶聯(lián)的抗兔IgG(1:30000)或HRP偶聯(lián)的抗小鼠IgG(1:30000)
檢測(cè)： Amersham ECL prime
成像： ImageQuant LAS 4000 mini(3分鐘，β-catenin；1分鐘，肌動(dòng)蛋白)

圖7.免疫蛋白印記法檢測(cè)（A）5種不同NIH 3T3細(xì)胞裂解物中 β-catenin和（B）5種不同Hela細(xì)胞裂解物中Tyr705磷酸化STAT3（pSTAT3）的表達(dá)水平。每個(gè)實(shí)例都對(duì)同一次免疫印跡中目標(biāo)蛋白以肌動(dòng)蛋白水平進(jìn)行標(biāo)化和相對(duì)定量。值得注意的是，雖然β-catenin的水平在印記的視覺(jué)檢測(cè)上非常相似，但通過(guò)ECL prime和ImageQuant LAS 4000 mini分析仍能找到之間明顯的差異。

低豐度磷酸化蛋白的檢測(cè)

STAT3是一種轉(zhuǎn)錄活化因子，參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展和宿主免疫。通過(guò)對(duì)細(xì)胞添加某種細(xì)胞因子如IFNa進(jìn)行處理可使蛋白上某個(gè)特異地酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化活化。

對(duì)起始量為12.5 μg IFNa處理的Hela細(xì)胞總蛋白進(jìn)行兩倍梯度稀釋，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠分離并印記在AmershamHybond-P膜上。通過(guò)特異的抗體和ECL prime對(duì)磷酸化的STAT3進(jìn)行檢測(cè)（圖8）。

樣品： 對(duì)12.5 μg的IFNa處理的Hela細(xì)胞裂解物總蛋白進(jìn)行2倍梯度稀釋
膜： Amersham Hybond-P
封閉： 5%牛血清白蛋白，溶解在PBS-T溶液中
一抗： 小鼠抗pSTAT3（Tyr705）（1:3000）
二抗： HRP偶聯(lián)的抗小鼠IgG（1:30000）
檢測(cè)： Amersham ECL prime/ Amersham ECL plus
成像： ImageQuant LAS 4000 mini（5分鐘）

圖8. 使用ECL prime和ECL plus對(duì)IFNa處理的Hela細(xì)胞中的pSTAT3進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。與ECL plus相比，ECL prime能產(chǎn)生更高強(qiáng)度的信號(hào)，這使得蛋白檢測(cè)的質(zhì)量即靈敏度得到改善。對(duì)照條帶為6.25 μg非處理細(xì)胞總蛋白。
訂購(gòu)信息
Product Code no.
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents for 1000 cm2 membrane1 RPN2232
1 Includes Solution A (luminol solution, 50 ml) and Solution B (peroxide solution, 50 ml), sufficient for 1000 cm2 membrane.
   
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Related products Code no.
Amersham Hybond-P (20 × 20 cm), 10 sheets RPN2020F
ECL Prime Blocking Agent, 20 g RPN418
ECL Human IgG, HRP-Linked Whole Ab (from sheep), 1 ml NA931-1ML
ECL Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab (from donkey), 1 ml NA934-1ML
Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers 250 l RPN800E
ECL DualVue Western Blotting Markers (25 loadings) RP N810
 
Imaging systems Code no.
ImageQuant LAS 4000 28-9558-10
 
Software and accessories Code no.
ImageQuant TL 7.0 and IQTL SecurITy 8.0 Software packages (with Getting Started guide) 28-9380-94
ImageQuant TL 7.01and ImageQuant TL SecurITy 8.0 (single user) 28-9332-73

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